利用胞嘧啶碱基编辑器高效制备奶牛BLG基因敲除胚胎的研究

[目的]β-乳球蛋白是由BLG基因编码的蛋白质,是牛乳中主要的过敏原。本试验旨在使用优化后的单碱基编辑器(CBE)YE1-BE3-FNLS和YE1-AncBE4max对牛胚胎BLG基因进行单碱基编辑,同时对2种单碱基编辑器在牛胚胎BLG基因敲除效果进行评价。[方法]在奶牛的BLG基因的第一外显子上设计sgRNA序列,通过胞嘧啶碱基编辑器将BLG基因第21位密码子CAG突变为TAG,实现c^(*).61 C>T(p.Q21^(*))的转变,获得终止密码子,使蛋白质翻译提前终止,达到基因敲除的目的。通过体外转录获得sgRNA以及YE1-BE3-FNLS和YE1-AncBE4max的mRNA,显微注射到奶牛胚胎中,收集囊胚,分别检测20枚YE1-BE3-FNLS编辑囊胚和24枚YE1-AncBE4max编辑囊胚,进行胚胎基因组PCR扩增,扩增BLG基因目标序列并进行测序验证编辑效率。根据sgRNA的序列,全基因组选择错配碱基最少的5个潜在脱靶位点进行脱靶检测。[结果]囊胚靶向编辑效率检测结果表明,YE1-AncBE4max对牛胚胎BLG基因的靶向编辑效率为83.3%(20/24)高于YE1-BE3-FNLS的靶向编辑效率60%(12/20),而前者存在较大的编辑窗口(C1-C9),可对sgRNA序列上的多个胞嘧啶进行编辑,后者具有较小的编辑窗口C2-C4;另外,YE1-BE3-FNLS具有较高的靶位点双链编辑效率35%(7/20),而YE1-AncBE4max只有2枚编辑胚胎发生双链编辑,纯合编辑率较低;2种单碱基编辑器制备的编辑胚胎均未出现插入缺失和脱靶效应。[结论]本文使用的2种胞嘧啶碱基编辑器均能高效制备奶牛BLG基因编辑胚胎,为进一步获得BLG基因单碱基敲除奶牛储备技术方法。

腺嘌呤碱基编辑器及其临床应用

人类遗传病致病基因一半以上是点突变,对其进行精确、高效的原位修复是遗传病治疗最理想的方式。鉴于点突变中大部分为鸟嘌呤(G)与腺嘌呤(A)之间的转换,而基于CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9)系统的腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor,ABE)通过将A转换为G,从而修复这些突变,因此该种碱基编辑在人类遗传病治疗中特别重要。近年来,ABE不断被优化,特别是碱基编辑器的活性和保真性均被提高。本文总结了有关ABE的研究进展,特别是ABE研发过程中重要的突变体,同时对现有ABE仍然存在的缺陷进行了思考。另外,对ABE在临床(含临床前研究)方面的相关应用也进行了回顾。本文为发现和优化新型ABE及其应用提供参考。

全球碱基编辑药物专利技术发展现状分析

目的把握我国碱基编辑器(BE)技术的市场竞争地位,为碱基编辑药物产业发展实现新跨域提供参考,也为培育新质生产力和新经济增长点奠定基础。方法通过incoPat平台获取并分析BE技术的相关专利数据,通过ClinicalTrials.gov数据库、中国临床试验注册中心及美国食品和药物管理局、国家药品监督管理局、科研院校和企业官方网站查询碱基编辑药物的临床试验情况或进展。专利数据截至2023年12月31日,检索和查询日期截至2024年6月30日。结果BE专利技术首次出现于2016年,此后处于技术高速发展阶段,创新主体不断致力于新型BE的研发、递送方式的优化、药物临床试验的开展等。在发达国家和人口密集国家布局较多专利以为后期临床试验、药物上市等做出充分准备。结论在政策引领下,我国碱基编辑药物的创新活跃性显著增强,但专利产业化模式还存在优化空间。国内外的碱基编辑药物在种类上竞争性低,尚有可进行专利布局的空间。

遗传性心律失常的基因治疗进展

遗传性心律失常是因单基因或多基因突变影响心肌离子通道或心肌结构进而影响心肌电生理特征的一类疾病,是导致心律失常乃至心源性猝死的一类重要原因。目前的主要治疗方案包括通过抗心律失常类药物、除颤器植入及手术等改善症状及降低猝死风险,但均无法阻止疾病进展,且患者需要长期承受疾病相关症状、治疗相关不良反应以及潜在猝死风险威胁。基因治疗则可通过编辑突变基因等多种方式达到稳定、长期的治疗效果,但多数治疗手段仍停留于实验室探索阶段。本文将对目前遗传性心律失常的基因治疗方法及研究进展进行综述。

基于胞嘧啶碱基编辑器构建ESM1基因敲除Hela细胞系

目的:基于胞嘧啶碱基编辑器(CBE)提前引入终止密码子构建内皮细胞特异性分子1(ESM1)基因敲除Hela细胞系。方法:根据NCBI数据库ESM1序列信息(Gene ID:11082),利用在线软件Benchling在ESM1基因1号外显子上设计2个向导sgRNA,构建对应的pX330-ESM1-sgRNA表达载体。将BE4max、ACBE-ASR、pX330-ESM1-sgRNA 3个质粒共转染Hela细胞,用嘌呤霉素富集筛选CBE工作阳性细胞。PCR扩增含靶点的序列并进行Sanger测序,比较2个sgRNA的效率。通过有限稀释法筛选单克隆细胞,扩大培养后进行测序及Western Blot检测。结果:测序结果显示pX330-ESM1-sgRNA表达质粒构建成功,sgRNA2的编辑效率为66%,远高于sgRNA1的编辑效率;10组细胞单克隆中有6组细胞的靶点进行了双等位基因精确编辑,成功提前引入了终止密码子;Western Blot结果显示ESM1被成功提前终止翻译,达到基因敲除的目的。结论:基于胞嘧啶碱基编辑器提前引入终止密码子的策略成功构建了ESM1基因敲除Hela细胞系,为后续研究ESM1在宫颈癌中的作用机制提供了实验材料,奠定了基础。

单碱基编辑技术在治疗遗传性贫血中的应用

单碱基编辑器(base editors,BEs)是一类基于CRISPR/Cas系统或转录激活子样效应子阵列蛋白(transcription activator-like effector,TALE)基因编辑技术的新兴碱基编辑器。该类编辑器既不需要引入DNA双键断裂,也不需要供体DNA,可针对基因组单个碱基进行精准替换,与以前的基因编辑技术相比,单碱基编辑器具有副产物更少、碱基编辑范围更大等优点,这为基因治疗点突变导致的遗传性贫血带来了曙光。本文对单碱基编辑技术的发展,以及单碱基编辑技术在基因治疗突变引起的遗传性贫血的临床尝试中取得的进展进行概述,可为未来临床上基因治疗遗传性贫血提供理论参考。

基因编辑技术在猪育种中的研究进展

以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术为猪育种提供了前所未有的新工具和新方法,不仅能突破现有遗传变异资源的限制,还可以缩短育种周期,提高育种效率。该文对基因编辑技术的研究进展及其在猪遗传育种方面的应用情况进行综合介绍,以期为相关科研人员、育种工作者以及政策制定者提供参考,进一步推动基因编辑技术在猪育种方面的应用。

基于文献计量分析的基因编辑技术发展研究

"基因编辑"技术指能够让人类对目标基因进行"编辑",实现对特定DNA片段的敲除、加入等的新兴生物学技术。为了解中国该领域的发展态势,本文运用文献计量法,基于2007—2017年Scopus基因编辑技术领域论文数据,对该技术领域的国际研究进展进行了整体分析,与国际主要国家对比分析了中国该领域SCI论文数量及其被引用情况,对核心作者、核心期刊、主要国家、专业研究机构及主要研发团队、申请专利数量和经济影响、主要分布学科以及研究前沿热点进行系统分析。旨在对我国和世界基因编辑技术领域的研究现状进行整体把握和分析,以期更好地应对新兴产业创新发展带来的机遇和挑战。

人类基因编辑行为治理研究

人类基因编辑作为新的社会现象,在有助于人类发展的同时,也具有非常巨大的伦理风险、技术风险、社会风险。从现实情况看,人类基因编辑的潜在风险和规制漏洞值得警惕和反思。要客观评价人类基因编辑行为,严格区分治疗与改进的不同用途,确立以治疗为目的的人类基因编辑原则,对治疗予以有条件认可,对改进予以严格禁止。要正视现有制度的不足,明确行为界限,强化主体的内在约束,进一步健全人类基因编辑的法律体系、监管体系,确保人类基因编辑既能规避各类风险,又能增进人类健康。

CRISPR/Cas9技术在卵巢癌诊疗及其转移相关机制研究中的进展

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,其治疗手段以手术为主,放、化疗作为卵巢癌术后的辅助治疗;晚期卵巢癌尤其容易发生远处转移,所以卵巢癌转移的诊疗也是我们卵巢癌临床治疗的重点。CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术系统相比传统的基因编辑技术来说可以更快获得基因敲除突变体,有望通过CRISPR/Cas9来解析卵巢癌的发生及转移机制,从而加速卵巢癌的研究。本文简要的介绍了CRISPR/Cas9技术以及近年来CRISPR/Cas9技术在卵巢癌的治疗及晚期发生、发展转移的应用现状及展望。

碱基编辑器介导的猪IGF2基因高效定点突变

本研究旨在利用碱基编辑器在巴马猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast cells,PFFs)中对生长性状相关基因胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)进行高效、精确的定点编辑。通过PCR扩增和测序对巴马猪和大白猪的IGF2基因序列进行鉴定,构建靶向巴马猪的sgRNA-IGF2表达载体,进而通过细胞转染、混合细胞编辑效率检测、单克隆细胞筛选及基因型鉴定等技术手段研究不同碱基编辑器对猪IGF2基因靶点的编辑效率及突变类型。结果显示,巴马猪和大白猪IGF2基因第3内含子存在第3072 bp处的单核苷酸多态性(SNP)位点,设计靶向巴马猪IGF2基因的单链寡核苷酸序列。单链寡核苷酸经退火后与BsaⅠ线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒进行重组连接,构建sgRNA-IGF2表达质粒,重组质粒测序结果表明,sgRNA序列已经精确连入U6启动子和sgRNA骨架之间。将rA1-BE3、hA3A-BE3、hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F 4种胞嘧啶碱基编辑器分别与sgRNA-IGF2表达质粒共转染至猪胎儿成纤维细胞中,对混合细胞编辑效率进行检测结果表明,对于IGF2基因靶点,hA3A-BE3系列碱基编辑器C到T的编辑效率显著高于rA1-BE3(P<0.05)。流式分选、单克隆细胞培养及鉴定结果表明,虽然有71.43%的hA3A-BE3单克隆细胞已被编辑,但有42.86%的细胞存在插入和缺失(indels);hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F的编辑效率(56.86%和40.38%)虽低于hA3A-BE3(71.43%),但是indels的效率也较低(31.37%和21.15%)。测序结果分析表明,利用碱基编辑器高效筛选到IGF2基因靶点纯合点突变的单克隆细胞。碱基编辑器作为新的基因编辑工具,可以对猪基因组中与经济性状关联的SNP位点进行高效、精确的基因修饰,为加速猪经济性状的遗传改良提供理论与实践基础。

单碱基水平上胞嘧啶碱基编辑器(CBE)的研究进展

尽管新一代基因编辑技术CRISPR/Cas9拥有众多优点,但在执行单个碱基水平的突变时其效率往往很低。由于DNA的双链断裂具有很多的不确定性,又加上基于供体模板的同源末端重组(homology directed repair,HDR)仅仅发生在分裂活跃的细胞中,而非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)在整个细胞周期中都可以发生,因此,传统CRISPR/Cas9在单碱基分辨率上进行基因编辑时存在一定弊端。碱基编辑器(base editor,BE)的出现则在一定程度上弥补了这一缺陷。胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor,CBE)或腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor,ABE)都能够在不引起双链断裂的情况下实现C·G到T·A或A·T到G·C的转换,极大地提高了单碱基编辑的应用价值。本文侧重对出现较早的CBE的原理、发展、应用及存在的问题进行综述,以期为高效单碱基突变工具在生物医学和畜牧业生产中的应用提供有益的参考和借鉴。

人类基因编辑的法律规制

人类基因编辑法律控制的基本理由在于其具有社会风险而非技术风险。其社会风险既涉及科技伦理评价,也涉及个体安全、社会安全、国家安全。未来,人类基因编辑要实现合法化,必须秉持有效预防、科研权利与科研义务相统一、强化责任公平分担等原则,要对人类基因编辑进行科学、明确的法律定位,明确合法化的标准和程序,建立起完善的法律制度体系,对其技术开发、利用、监管等活动全面规范,确保其符合科技伦理,有助于科技发展,也有助于人类整体福利的提高。

CRISPR/Cas及其衍生编辑技术在基因治疗中的应用进展

基因治疗是指利用基因编辑技术对细胞基因进行"修饰"而达到治疗的目的。CRISPR/Cas的出现为基因编辑提供了简单、高效和多功能的平台,同时,为克服DNA双链断裂产生的不良影响,基于CRISPR/Cas的新型技术,如碱基编辑器(base editors,BE)、Prime Editors(PE)和Cas13效应器,被相继开发出来。目前,CRISPR/Cas及其衍生编辑技术已被广泛应用于动物细胞模型构建、药物靶点筛查和基因功能研究等领域,在基因治疗领域也展现出广阔的应用前景。基于此,简要介绍了CRISPR/Cas及其衍生编辑技术,综述了其在单基因遗传病、肿瘤和其他疾病的基因治疗中的应用进展,并分析了其当下面临的挑战,以期为基因编辑在单基因遗传病、肿瘤和其他疾病治疗领域提供理论参考。

CRISPR技术在生物学与医学中的研究进展

作为一项新兴技术,CRISPR近年来发展迅速,其在疾病检测、模式生物构建、基因治疗领域的研究硕果累累。由于CRISPR技术原理简单、操作简易,并可与多种技术结合等优点,使之在医药、农业、环境等领域的应用具有巨大潜力。此外,除了经典的CRISPR/Cas9系统,科学家还发现了多种其他类型的CRISPR/Cas系统。同时,基于Cas9蛋白开发的单碱基编辑器(BE)和可对RNA进行编辑的CRISPR/Cas13a系统也使CRISPR的应用范围得到了极大地扩展,将对CRISPR技术的最新进展及其在生物学、医学等领域的应用进行综述。

基因编辑研究进展与展望

CRISPR-Cas9技术的发展极大地推动了基因编辑技术的进步,基于该技术开发的碱基编辑器和先导编辑器赋予了CRISPR-Cas9系统更加强大的基因编辑能力,加速了CRISPR-Cas9技术应用于临床基因治疗。虽然目前对该系统做了诸多优化和改进,但在特异性、安全性以及在体转导等方面仍存在改进和优化的空间。本文针对这三方面的研究进展进行简要介绍和展望。

论基因编辑人的刑事注意义务

基因编辑人有三重人格,即生物人人格、职业人格和基因编辑人人格,基因编辑人因基因编辑人人格负有刑事特殊注意义务。现有法律体系的适用对象是自然出生的人类和人组成的“单位”,不能从法律对自然出生的人设定的规则而当然的推导基因编辑人所应负的刑法上的义务。因此,基因编辑人在义务承担上不应与自然出生的人类一致,刑事立法应设专门规定对基因编辑人予以规范。宜根据被编辑的基因,承认基因编辑人的生物人人格,参照职业人格设计基因编辑人人格,规定基因编辑人承担相应的特别注意义务,违背此特别注意义务的,应承担刑法上的不利后果。如对特殊疾病免疫者应定期去做体检,否则因其传染给他人自身免疫的疾病而导致该特定人或人群死伤的,应追究其故意伤害或杀人罪。

CRISPR/Cas9基因编辑技术在心血管领域中的研究进展

CRISPR/Cas9基因编辑技术以其独特的优势已经在生物医学领域中被广泛应用。利用该技术在人类心血管疾病的相关研究如:心肌细胞水平、先天性心脏病动物模型建立、冠心病高危因素、心律失常、心力衰竭和心肌病等方面已经取得了很大进步,但目前的基因编辑技术在实际运用中仍然面临着许多问题。

严谨实验结果现真知——中国学者成功解开基因编辑脱靶疑团

基因编辑技术在修复致病突变与种质改良方面都有重要的发展前景,被广泛使用于基础与应用研究中。该技术的真实脱靶率一直存在争议,严重阻碍了其发展。2019年3月,杨辉、高彩霞分别领导的两项研究终于揭示了脱靶的奥秘,其成果同时在《Science》发表。在小鼠与水稻中的研究一致发现:胞嘧啶编辑器会造成严重的点突变,而腺嘌呤编辑器与经典的CRISPR/Cas9技术没有明显的脱靶效应。文章综述了脱靶的疑团为何长期未解,最新研究是如何通过构建严谨的实验对照实现了精密的脱靶检测并得到严谨的数据与结论,同时初步讨论了在风险未能排除之前,人类必须谨慎开展人体临床试验。

CRISPR/Cas9技术在农作物育种中的应用

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,规律间隔的成簇短回文重复序列)/Cas9(CRISPR-associated protein 9,CRISPR相关蛋白9)系统是一种强大的基因编辑工具,因其成本低、可操作性强、编辑效率高等优点,已被大量应用于农作物改良中。文章综述了CRISPR基因编辑系统的发现、分类、作用机制以及CRISPR/Cas9在农作物改良上的应用,并展望其未来的发展前景。