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Metabolic regulation of <i>Escherichia coli</i>cultivated under anaerobic and aerobic conditions in response to the specific pathway gene knockouts
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作者 Yu Matsuoka Kazuyuki Shimizu 《Advances in Bioscience and Biotechnology》 2013年第3期455-468,共14页
Effect of the specific gene knockout on the main metabolism in Escherichia coli was reviewed, and the regulation mechanisms were clarified based on different levels of information such as gene expressions, enzyme acti... Effect of the specific gene knockout on the main metabolism in Escherichia coli was reviewed, and the regulation mechanisms were clarified based on different levels of information such as gene expressions, enzyme activities, intracellular metabolite concentrations, and metabolic fluxes together with fermentation data. The effects of the knockout of such genes as pflA, pta, ppc, pykF, adhE, and ldhA on the metabolic changes were analyzed for the case under anaerobic condition. The effects of the knockout of such genes as pgi, zwf, gnd, ppc pck, pyk, and lpdA on the metabolic changes were also analyzed for the case under aerobic condition. The metabolic regulation analysis was made focusing on the roles of transcription factors. 展开更多
关键词 Metabolic Regulation SINGLE-gene knockout mutant ESCHERICHIA coli
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斑马鱼adgrf3a基因敲除品系的构建
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作者 杨曙 伍伟景 +5 位作者 赖若沙 汪芹 张康佳 张勇 肖自安 谢鼎华 《激光生物学报》 CAS 2023年第5期423-430,共8页
adgrf3a基因编码的ADGRF3A蛋白是黏附类G蛋白偶联受体(aGPCRs)家族的一员,主要在受精后5 d的胚胎以及成年斑马鱼的头部和性腺中表达。它含有一个GPS蛋白水解位点和7个跨膜结构域,与G蛋白相互作用行使其功能。斑马鱼是研究早期发育和成... adgrf3a基因编码的ADGRF3A蛋白是黏附类G蛋白偶联受体(aGPCRs)家族的一员,主要在受精后5 d的胚胎以及成年斑马鱼的头部和性腺中表达。它含有一个GPS蛋白水解位点和7个跨膜结构域,与G蛋白相互作用行使其功能。斑马鱼是研究早期发育和成体内生理和病理的重要模式生物。为了研究adgrf3a在斑马鱼早期发育中的作用,我们利用CRISPR-Cas9技术构建了adgrf3a基因敲除斑马鱼品系。首先,通过分析软件筛选出该基因的敲除位点,利用聚合酶链式反应扩增该基因的向导DNA(sgDNA),再以sgDNA为模板进行体外转录得到向导RNA(sgRNA)并纯化回收,将纯化后的sgRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼1细胞期胚胎中,得到F0代嵌合体。随后,对斑马鱼胚胎进行基因编辑的有效性检测,结果表明,注射的胚胎出现了碱基缺失的现象,即sgRNA有效,将剩余胚胎培养至成鱼。将嵌合体与野生型斑马鱼杂交所得的F1代斑马鱼进行基因型鉴定,筛选adgrf3a突变杂合子,并对其adgrf3a突变位点进行Sanger测序,建立能够稳定遗传的adgrf3a基因杂合突变品系。之后,adgrf3a突变杂合子斑马鱼自交,获得adgrf3a纯合子突变斑马鱼。体视显微镜观察其成像发现,adgrf3a突变纯合子斑马鱼与野生型整体上未出现明显差异,然而,体内组织与器官的发育是否发生变化需要进一步验证。该基因敲除品系的建立为研究adgrf3a在早期发育及病理过程中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 斑马鱼 adgrf3a CRISPR-Cas9 基因敲除 基因杂合突变品系
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Red重组系统在痢疾杆菌基因敲除中的应用研究 被引量:15
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作者 胡堃 史兆兴 +2 位作者 王恒樑 冯尔玲 黄留玉 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期740-746,共7页
利用λ噬菌体的Red系统在细菌中进行基因敲除的技术 ,最近发展较快 ,但多在大肠杆菌中进行。以alkA、wcaJ、yphF和dam 4个基因为例 ,分别在大肠杆菌和痢疾杆菌中利用Red系统进行基因敲除。对于大肠杆菌 ,除dam基因外 ,其余 3个基因均能... 利用λ噬菌体的Red系统在细菌中进行基因敲除的技术 ,最近发展较快 ,但多在大肠杆菌中进行。以alkA、wcaJ、yphF和dam 4个基因为例 ,分别在大肠杆菌和痢疾杆菌中利用Red系统进行基因敲除。对于大肠杆菌 ,除dam基因外 ,其余 3个基因均能被有效敲除 ,而在痢疾杆菌中只能敲除一个alkA基因。结果表明 ,为使该系统能有效地应用于痢疾杆菌和其它细菌 ,还需对该系统进行改进。 展开更多
关键词 Red系统 基因敲除 突变体 重组系统 痢疾杆菌
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烟曲霉Af293 chsD基因缺失突变株的构建 被引量:3
4
作者 张玲 刘超 +4 位作者 龙朝钦 陈诗平 曾海燕 罗文霞 刘品梅 《中国皮肤性病学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期447-450,527,共5页
目的构建Af293 chs D缺失突变株,并对chs D的功能进行初步的研究。方法 PCR扩增chs D两侧部分序列并连接至p PK2质粒的潮霉素表达盒两端,从而构建重组质粒p PK2/chs D-(L+R)。酶切p PK2/chs D-(L+R)并胶回收含chs D左侧、hph表达盒及ch... 目的构建Af293 chs D缺失突变株,并对chs D的功能进行初步的研究。方法 PCR扩增chs D两侧部分序列并连接至p PK2质粒的潮霉素表达盒两端,从而构建重组质粒p PK2/chs D-(L+R)。酶切p PK2/chs D-(L+R)并胶回收含chs D左侧、hph表达盒及chs D右侧的片段,连接至p DHt/SK而构建二元质粒p DHt/chs D::hph。经ATMT方法将p DHt/chs D::hph转化至Af293,经潮霉素抗性筛选从而获得烟曲霉△chs D突变株,并测量Af293,△chs D突变株生长直径及扫描电镜下观察分生孢子形态。结果经PCR初步鉴定,筛选出的突变株中,其染色体中的chs D序列已被hph置换,初步形态研究表明,△chs D突变株的生长速度显著低于Af293野生型,且分生孢子凹陷呈干瘪状。结论成功获得Af293△chs D突变株。chs D基因功能初步研究表明,chs D可能与烟曲霉的生长相关。 展开更多
关键词 烟曲霉 chsD 基因置换 突变株
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文昌鱼Hedgehog基因敲除和突变体表型分析 被引量:5
5
作者 王慧 李光 王义权 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2015年第10期1036-1043,共8页
文昌鱼隶属脊索动物门头索动物亚门,是无脊椎动物到脊椎动物的过渡类群,其躯体结构简单,是研究胚胎发育的理想材料。本文以文昌鱼为实验对象,利用TALEN敲除技术对Hedgehog(Hh)基因在胚胎发育中的功能进行了研究。在文昌鱼Hh基因翻译起... 文昌鱼隶属脊索动物门头索动物亚门,是无脊椎动物到脊椎动物的过渡类群,其躯体结构简单,是研究胚胎发育的理想材料。本文以文昌鱼为实验对象,利用TALEN敲除技术对Hedgehog(Hh)基因在胚胎发育中的功能进行了研究。在文昌鱼Hh基因翻译起始位点下游附近选取TALEN目标位点,根据此序列组装相应TALEN重组质粒,体外合成m RNA,向未受精卵注射m RNA后,经体外受精获得F0代胚胎。效率分析显示,靶向该基因的TALEN m RNA可导致F0代代胚胎在相应基因组区域发生突变的比例为34%。对部分F0个体所产配子筛查发现,TALEN引起的突变可进入配子,将其中1尾突变类型为8 bp缺失的雄性个体与野生型雌性配对获得F1群体,对F1群体逐尾筛查,从中获得多尾携带8 bp缺失的杂合子;这些杂合子相互配对所产的F2代胚胎,其中约有1/4个体在幼体早期出现躯体前端和尾向下弯曲、脊索前端腹侧的中胚层组织发育不全,不能开口等;随着幼体生长发育,躯体前端和尾部进一步卷曲,口部仍未形成,左右各形成一个口前窝,内柱和鳃裂位于躯体腹侧,最终因无口摄食而死亡。基因型分析发现,上述畸形胚胎均为Hh纯合突变体,其与杂合子及野生型比例分布符合孟德尔遗传定律,表明这些发育畸型的特征与Hh基因功能缺失有关。 展开更多
关键词 基因敲除 文昌鱼 Hedgehog基因 突变体
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枯草芽孢杆菌S44菌株ituD基因敲除突变株的构建 被引量:1
6
作者 张慧 陈莉 赵思峰 《湖北农业科学》 北大核心 2014年第6期1436-1439,共4页
利用同源重组基因敲除方法构建了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S44 ituD基因同源突变株。菌落PCR、RT-PCR、SDS-PAGE结果均显示ituD基因缺失突变株构建成功。野生株与突变株的菌落形态、生长速率以及抑菌活性均有显著差异。抑菌活性... 利用同源重组基因敲除方法构建了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S44 ituD基因同源突变株。菌落PCR、RT-PCR、SDS-PAGE结果均显示ituD基因缺失突变株构建成功。野生株与突变株的菌落形态、生长速率以及抑菌活性均有显著差异。抑菌活性试验结果显示,突变株抑菌活性显著减弱,成功构建的ituD基因突变株为进一步研究ituD基因的生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ituD基因 敲除突变株 抑菌活性
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降解布洛芬克隆菌株转座子插入突变体的构建 被引量:1
7
作者 卫亚红 段敏 +2 位作者 向照举 曲东 王瑶 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2016年第4期135-141,共7页
【目的】敲除布洛芬福斯质粒文库克隆菌株4F6中的邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因(C23O),构建其Tn5插入突变体,为布洛芬降解调节因子的深入研究奠定基础。【方法】以构建好的3G7Tn5突变体菌株为基础,借助pKD46质粒的λ-red同源重组酶,将转座... 【目的】敲除布洛芬福斯质粒文库克隆菌株4F6中的邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因(C23O),构建其Tn5插入突变体,为布洛芬降解调节因子的深入研究奠定基础。【方法】以构建好的3G7Tn5突变体菌株为基础,借助pKD46质粒的λ-red同源重组酶,将转座子Tn5从菌株3G7中电击转化至4F6,消除pKD46质粒,敲除4F6菌株中的C23O基因,测定出发菌株3G7、4F6及Tn5插入突变体菌株3G7-G9、3G7-H5、4F6-G9和4F6-H5间位苯环的裂解活性。【结果】42℃条件下消除了Tn5插入突变体受体菌4F6中的pKD46质粒,构建了4F6-G9和4F6-H5突变体。Tn5转座子插入突变株3G7-G9、3G7-H5、4F6-G9和4F6-H5的间位苯环裂解活性无显著差异;菌株4F6的间位苯环裂解活性虽明显高于菌株3G7,但也仅有1个C23O基因,其活性差异可能与布洛芬降解调控因子有关。【结论】提供了一种简便有效定位并敲除C23O基因的方法。 展开更多
关键词 可降解布洛芬福斯质粒 Tn5突变体 基因敲除
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双元载体提供组蛋白H3/H4拷贝1的elp3Δ菌株的构建 被引量:1
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作者 李芬 田树娟 《河南师范大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期95-98,共4页
人Elongator是在转录中有功能的组蛋白乙酰转移酶(HAT)复合物,为研究其催化亚基Elp3功能,构建了酵母组蛋白H3/H4拷贝1的双元表达载体pRS316CFT,通过PCR介导的基因敲除,获酵母基因组H3/H4缺失由双元载体提供单拷贝H3/H4的elp3Δ菌株.敏... 人Elongator是在转录中有功能的组蛋白乙酰转移酶(HAT)复合物,为研究其催化亚基Elp3功能,构建了酵母组蛋白H3/H4拷贝1的双元表达载体pRS316CFT,通过PCR介导的基因敲除,获酵母基因组H3/H4缺失由双元载体提供单拷贝H3/H4的elp3Δ菌株.敏感性实验表明该载体提供H3/H4可维持酵母正常生长.本工作为构建H3/H4乙酰化位点突变菌株,用功能互补在体内研究人Elp3 HAT活性功能奠定了基础. 展开更多
关键词 双元表达载体 基因敲除 酵母突变株
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单增李斯特菌vip基因缺失菌株的构建与筛选 被引量:1
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作者 李森 牟俊洁 刘武康 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2017年第4期16-22,共7页
单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是广泛存在于自然界及食物中的食源性致病菌,作为胞内寄生菌,它可以引起强烈的细胞免疫,是潜在的优良疫苗载体。vip是单增李斯特菌的毒力基因,与其侵袭能力密切相关。因此构建vip基因敲除株可为单... 单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是广泛存在于自然界及食物中的食源性致病菌,作为胞内寄生菌,它可以引起强烈的细胞免疫,是潜在的优良疫苗载体。vip是单增李斯特菌的毒力基因,与其侵袭能力密切相关。因此构建vip基因敲除株可为单增李斯特菌疫苗载体的研发打下重要基础。从单增李斯特菌EGDe基因组中扩增出vip基因上、下游序列,连接到穿梭载体p KSV7中得到敲除载体p KSV7-Δvip,将其以电穿孔的方式转入单增李斯特菌后,通过同源重组利用氯霉素和温度双重压力筛选得到vip基因的敲除突变株,并对敲除菌株的生长曲线进行分析发现vip敲除对细菌的生长没有显著影响,为进一步研究vip基因功能、单增李斯特的致病机制和疫苗载体的研发提供参考。 展开更多
关键词 单增李斯特菌 rip基因敲除 突变株 同源重组
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RgpAc基因对变形链球菌生物学特性影响的研究
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作者 谢苗苗 吴补领 闫文娟 《口腔医学研究》 CAS CSCD 2013年第9期791-795,共5页
目的:研究变形链球菌RgpAc基因缺失对生物膜形成、生物膜结构及细菌胞外多糖形成的影响。方法:采用变形链球菌野生菌株和RgpAc基因敲除菌株,分别进行生物膜形成量的测定、生物膜结构的扫描电镜观察及细菌胞外多糖形成量的实验,对结果进... 目的:研究变形链球菌RgpAc基因缺失对生物膜形成、生物膜结构及细菌胞外多糖形成的影响。方法:采用变形链球菌野生菌株和RgpAc基因敲除菌株,分别进行生物膜形成量的测定、生物膜结构的扫描电镜观察及细菌胞外多糖形成量的实验,对结果进行统计学分析处理。结果:变形链球菌RgpAc基因敲除菌株的生物膜形成量比野生菌株少,差异有统计学意义。低倍电镜下观察生物膜结构菲薄松散,细菌在釉质表面的粘附量少,高倍电镜下观察细胞外基质减少。结论:变形链球菌RgpAc基因被敲除后,细菌合成胞外多糖的能力下降,从而导致变形链球菌生物膜形成能力下降,结构疏松,同时细菌产糖量下降,细菌对生物膜的粘附性降低。 展开更多
关键词 变形链球菌 RgpAc基因敲除菌株 生物膜 细胞外多糖
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苏云金芽胞杆菌XL6 BTXL6_11095基因对生物被膜相关表型的调控 被引量:1
11
作者 马胜龙 凡肖 +7 位作者 姚俊敏 吴华川 束长龙 商铭达 张韶芮 杨郑豪 关雄 黄天培 《中国生物防治学报》 CSCD 北大核心 2019年第1期53-62,共10页
在细菌生物被膜(bacterial biofilm, BBF)状态下,细菌往往具有更强的抗紫外线能力、环境适应性和耐药性。本课题组在前期工作中通过转座子插入突变强生物被膜产生菌苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)XL6,筛选出了一个可能调控... 在细菌生物被膜(bacterial biofilm, BBF)状态下,细菌往往具有更强的抗紫外线能力、环境适应性和耐药性。本课题组在前期工作中通过转座子插入突变强生物被膜产生菌苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)XL6,筛选出了一个可能调控生物被膜的基因BTXL6_11095。本文以该基因为研究对象,通过生物信息学手段分析该基因功能,构建了BTXL6_11095基因敲除菌株,并对其生物被膜相关表型进行了分析。生物信息学分析结果表明BTXL6_11095基因的结构域为PAS-GGDEF-GGDEF-EAL。生物被膜相关表型分析表明,与野生菌株相比,基因敲除菌株的生长曲线基本不变,群游能力上升,生物被膜形成能力减弱、UV-B抗性降低。本研究通过对BTXL6_11095基因表型变化综合评估,从功能角度揭示此基因对Bt XL6生物被膜相关表型的影响,为进一步解析Bt XL6生物被膜调控网络和构建高抗UV的工程生物被膜奠定了基础。 展开更多
关键词 生物被膜 苏云金芽胞杆菌 基因敲除 生物信息学分析
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水稻愈伤诱导过程中生长素通路的初步研究 被引量:1
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作者 段镇淳 张昭阳 林拥军 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期98-104,共7页
构建水稻LBD基因家族中CRL1基因的CRISPR/CAS9基因敲除载体,并转化中花11水稻愈伤,获得了8个转基因片段缺失家系;对CRL1基因敲除材料种子进行愈伤诱导实验;结果显示,它们的愈伤组织诱导受到了强烈抑制,与已知的水稻OsIAA10基因的RNA干... 构建水稻LBD基因家族中CRL1基因的CRISPR/CAS9基因敲除载体,并转化中花11水稻愈伤,获得了8个转基因片段缺失家系;对CRL1基因敲除材料种子进行愈伤诱导实验;结果显示,它们的愈伤组织诱导受到了强烈抑制,与已知的水稻OsIAA10基因的RNA干扰材料表型相似。进行OsIAA10的亚细胞定位实验,结果显示,OsIAA10同时定位在细胞核与细胞膜上。通过酵母双杂交筛库实验,发现OsIAA10能与OsARF家族成员中的OsARF5、OsARF1、OsARF721、OsARF23四个转录因子发生互作。以CRL1基因启动子为诱饵构建载体,进行酵母单杂交点对点实验,结果显示,这4个转录因子中只有OsARF5与OsARF21能特异性结合CRL1基因启动子区的AuxRE基序,激活CRL1基因转录。本研究结果初步证明水稻侧根发育通路与愈伤组织诱导过程存在直接相关,水稻与双子叶植物之间存在保守的生长素调控机制,在水稻种子的愈伤组织诱导过程中发挥着重要的作用。 展开更多
关键词 水稻 生长素通路 愈伤诱导 OsIAA10 CRL1 酵母双杂交 基因敲除 根发育 超表达突变体
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庆大霉素生物合成基因genN的研究
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作者 张熠 洪文荣 潘成奇 《工业微生物》 CAS CSCD 2015年第1期50-55,共6页
利用生物信息学方法分析庆大霉素生物合成特色基因gen N的功能,构建gen N缺失的基因工程菌。首先运用分子生物学技术构建同源重组质粒p FU604,其次重组质粒经接合转移导入绛红色小单孢菌M.purpurea GK1101。最后,基于同源重组机制,利用... 利用生物信息学方法分析庆大霉素生物合成特色基因gen N的功能,构建gen N缺失的基因工程菌。首先运用分子生物学技术构建同源重组质粒p FU604,其次重组质粒经接合转移导入绛红色小单孢菌M.purpurea GK1101。最后,基于同源重组机制,利用安普霉素抗性筛选及PCR鉴定,得到gen N基因缺失的工程菌(M.purpurea GKN-27)。结果显示:较岀发菌GK1101,基因工程菌GKN-27不再继续合成庆大霉素C1a和C2b,阻断庆大霉素生物合成代谢流,并积累分子量为497、524、523、503四种新的中间代谢物,新的中间代谢物将有望开发新型药物。同时,也表明gen N不是C-6'N甲基化酶编码基因。 展开更多
关键词 庆大霉素 基因敲除 genN 工程菌构建 生物信息学
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棒曲霉孢子发育相关基因flbA的克隆和缺失突变株的鉴定
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作者 蒋冬花 吕梦霞 +2 位作者 史婷婷 丁允章 许楚旋 《浙江师范大学学报(自然科学版)》 CAS 2020年第1期1-7,共7页
在模式真菌构巢曲霉中,FlbA蛋白位于分生孢子中心调控途径上游,对分生孢子的形成起激活作用.研究以1株实验室筛选的高产洛伐他汀棒曲霉Ac-32专利菌株的基因组为模板,克隆分生孢子发育相关基因flbA,用双接头PCR法构建flbA基因敲除盒,用... 在模式真菌构巢曲霉中,FlbA蛋白位于分生孢子中心调控途径上游,对分生孢子的形成起激活作用.研究以1株实验室筛选的高产洛伐他汀棒曲霉Ac-32专利菌株的基因组为模板,克隆分生孢子发育相关基因flbA,用双接头PCR法构建flbA基因敲除盒,用根癌农杆菌介导转化法构建棒曲霉转化子库,依据转化子表型特征和分子特征鉴定flbA基因缺失突变株.结果表明:flbA基因全长为2208 bp,翻译对应的氨基酸为734个,理论分子量和等电点分别为78798.75 Da和8.64;棒曲霉与构巢曲霉flbA基因序列同源性为69.9%,氨基酸序列的同源性为76.6%;构建了flbA基因敲除盒和敲除载体,获得了258株棒曲霉转化子,经鉴定得到了1株flbA基因缺失突变株.研究成果为后续探讨棒曲霉flbA基因功能提供了材料,并奠定了理论基础. 展开更多
关键词 棒曲霉 分生孢子 flbA基因 克隆 敲除载体 缺失突变株
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Analyses of Sexual Reproductive Success in Transgenic and/or Mutant Plants
15
作者 Cristiane P. G. Calixto Gustavo H. Goldman Maria Helena S. Goldman 《Journal of Integrative Plant Biology》 SCIE CAS CSCD 2009年第8期719-726,共8页
The pistil, the female reproductive organ of plants, is a key player in the success of sexual plant reproduction. Ultimately, the production of fruits and seeds depends on the proper pistil development and function. T... The pistil, the female reproductive organ of plants, is a key player in the success of sexual plant reproduction. Ultimately, the production of fruits and seeds depends on the proper pistil development and function. Therefore, the identification and characterization of pistil expressed genes is essential for a better understanding and manipulation of the plant reproduction process. For studying the function of pistil expressed genes, transgenic and/or mutant plants for the genes of interest are used. The present article provides a review of methods already exploited to analyze sexual reproductive success. We intend to supply useful information and to guide future experiments in the study of genes affecting pistil development and function. 展开更多
关键词 knockout mutant plants overexpression transgenic plants pistil expressed genes plant sexual reproduction reproductive success silenced transgenic plants.
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多主棒孢CcCas2基因纯合敲除突变体构建及致病功能 被引量:2
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作者 侯梦圆 武海燕 +5 位作者 何雨芯 郭雅双 耿月华 臧睿 张猛 徐超 《菌物学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期1701-1717,共17页
多主棒孢引起的棒孢叶斑病为我国黄瓜生产上重要的新兴流行病害。多主棒孢寄主广泛,其cassiicolin(Cas)毒素是多主棒孢侵染橡胶早期的关键致病因子,但在黄瓜/多主棒孢病害系统中的毒力功能目前尚不明确。本研究从来自黄瓜多主棒孢HG3菌... 多主棒孢引起的棒孢叶斑病为我国黄瓜生产上重要的新兴流行病害。多主棒孢寄主广泛,其cassiicolin(Cas)毒素是多主棒孢侵染橡胶早期的关键致病因子,但在黄瓜/多主棒孢病害系统中的毒力功能目前尚不明确。本研究从来自黄瓜多主棒孢HG3菌株的基因组序列中鉴定到单拷贝的Cas2亚型基因,命名为CcCas2。在敲除该基因的过程中,发现CcCas2缺失突变体均为杂合,荧光染色试验进一步证实多主棒孢是多核真菌。对杂合突变体进行潮霉素筛选并单孢纯化,获得了纯合的CcCas2缺失突变体菌株(检出率≥20%)。致病力测定显示,CcCas2纯合突变体和野生型菌株接种黄瓜叶片4 d后的发病程度相当。通过转录组数据、RT-PCR和qRT-PCR分析均发现CcCas2在转录水平上受到了强烈地抑制。本研究明确了多主棒孢CcCas2基因由于在转录水平受到抑制而对黄瓜没有毒力;所提出的多主棒孢纯合突变体高效获取方法为该菌进一步的功能基因研究奠定了基础。 展开更多
关键词 多主棒孢 效应蛋白 多核丝状真菌 杂合敲除突变体 基因表达
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基于RNA-seq的香蕉枯萎病菌Cat1基因敲除突变体分析
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作者 陈亚 郑玉华 +1 位作者 彭明 李春强 《分子植物育种》 CAS 北大核心 2023年第7期2161-2173,共13页
本研究通过RNA-seq技术对Δcat1突变体菌株和Foc4野生型菌株的转录组进行了比较分析。为探明Cat1基因敲除后对香蕉枯萎病菌转录组的影响。预测到新转录本2354个,其中能够预测到基因功能的有1095个。Cat1基因敲除后,敲除突变体的基因表... 本研究通过RNA-seq技术对Δcat1突变体菌株和Foc4野生型菌株的转录组进行了比较分析。为探明Cat1基因敲除后对香蕉枯萎病菌转录组的影响。预测到新转录本2354个,其中能够预测到基因功能的有1095个。Cat1基因敲除后,敲除突变体的基因表达相较于野生型菌株发生很大变化。差异表达基因GO功能富集发现,差异基因表达主要体现在蛋白复合物、细胞质组分、细胞蛋白代谢过程、ATP结合和转运活性等相关方面。KEGG分析发现,敲除突变体与野生型菌株的差异表达基因主要集中在核糖体合成、RNA转运,香蕉处理后差异表达基因集中在抗生素生物合成、次生代谢物生物合成等通路。Cat1基因敲除后,一些能量转运酶、加氧酶、氨基酸转移酶活动加强,一些激酶、氧化酶、蛋白酶受香蕉诱导活性增加。Cat1的敲除导致多种糖转运蛋白的大幅下调表达,且大大影响锌脂蛋白和细胞周期蛋白等表达,从而对菌株生命活动和致病力产生影响。Cat1敲除后,其他过氧化氢酶类的表达量补偿性增加,但催化生成过氧化氢的SOD表达也增加,可能是敲除突变体致病力减弱的原因之一。本研究为进一步揭示香蕉枯萎病菌的致病机理提供理论依据。 展开更多
关键词 过氧化氢酶 敲除突变体 转录组测序 尖孢镰刀菌古巴专化型 基因表达
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尖镰孢古巴专化型4号小种T-DNA插入突变体Focr4-1562及其基因敲除子的生物学表型研究 被引量:8
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作者 吴飞宏 曾涛 +2 位作者 陈汉清 曾会才 彭明 《菌物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期584-592,共9页
尖镰孢古巴专化型4号小种Fusarium oxysporumf.sp.cubenserace4(Focr4)是引起毁灭性土传病害香蕉枯萎病的危害性最大的小种,至今其致病机理尚不清楚。对已获得的野生型菌株Focr4-193-6经基因T-DNA插入引起致病性严重减弱的突变体Focr4-1... 尖镰孢古巴专化型4号小种Fusarium oxysporumf.sp.cubenserace4(Focr4)是引起毁灭性土传病害香蕉枯萎病的危害性最大的小种,至今其致病机理尚不清楚。对已获得的野生型菌株Focr4-193-6经基因T-DNA插入引起致病性严重减弱的突变体Focr4-1562及其插入失活基因的敲除子△Focr4-1562的生物学表型进行了研究。玻璃纸穿透试验、活体叶片接种及根部接种致病性测定的结果表明,插入突变体和敲除子不能穿透玻璃纸生长,叶片接种和根部接种未见有明显病斑和球茎维管束变褐症状;野生型菌株则能穿透玻璃纸生长,叶片接种部位表现明显症状,被接种根部和球茎的维管束表现变褐症状。T-DNA插入突变体Focr4-1562和其基因敲除子△Focr4-1562的致病性表型一致,初步鉴定为致病性严重减弱。营养生长及形态学观察结果表明,野生型、插入突变体及其敲除子的最适生长温度均在28℃,最适的生长pH值为7.0-8.0之间,插入突变体及其敲除子的孢子形态与野生型Focr4-193-6相比并没有显著的变化,但敲除子△Focr4-1562的产孢量降低,插入突变体及其敲除子对细胞壁降解酶的抗性大大增强,说明被敲除的致病相关基因与Focr4-193-6分生孢子产生及细胞壁的形成有关。 展开更多
关键词 香蕉枯萎病 T-DNA 插入突变体 基因敲除 生物学特性
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猪链球菌2型强毒株sly基因敲除株构建及生物学特征分析
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作者 孙雯 郑峰 《生物技术》 CAS 北大核心 2017年第1期45-52,共8页
[目的]构建猪链球菌2型05ZYH33溶血素sly基因敲除突变株,比较突变株与野生株生物学特征。[方法]分别克隆sly上游序列L、下游序列R和壮观霉素抗性基因spcr,构建基因敲除质粒p UC18-LSR,并电转化入05ZYH33感受态细菌。用多重PCR、RT-PCR及... [目的]构建猪链球菌2型05ZYH33溶血素sly基因敲除突变株,比较突变株与野生株生物学特征。[方法]分别克隆sly上游序列L、下游序列R和壮观霉素抗性基因spcr,构建基因敲除质粒p UC18-LSR,并电转化入05ZYH33感受态细菌。用多重PCR、RT-PCR及Southern杂交对sly基因敲除突变株进行鉴定。比较突变株与野生株的生长速率和溶血现象。[结果]多重PCR和RT-PCR分别显示,野生株DNA和c DNA都能扩增出579 bp的sly内部片段,而突变株DNA和c DNA都未能扩增出此片段。Southern杂交显示,突变株中未见sly探针杂交条带。突变株生长速率较野毒株迟缓,溶血能力减弱,但依然存在。[结论]建立了高效稳定的电转化方法,成功构建出溶血能力减弱的双交换同源重组sly基因敲除突变株。 展开更多
关键词 猪链球菌2型 溶血素 基因敲除 突变株 野生株 生长曲线 溶血
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