FOXN1基因敲除兔嵌合体的建立

目的建立F0代FOXN1基因敲除兔嵌合体,以探究普通饲养环境免疫缺陷兔活体保种的方法。方法首先,利用CRISPR/Cas9技术,将构建好的sgRNA和Cas9蛋白注入兔二细胞期胚胎的一个细胞中,以获得FOXN1基因编辑嵌合体胚胎。然后,胚胎移植至代孕母兔。最后,通过PCR技术以及Sanger测序方法鉴定F0代仔兔基因型,并观察其在普通饲养环境生长发育的情况。结果PCR结合Sanger测序结果表明FOXN1基因敲除兔嵌合体构建成功。经观察,嵌合体在普通环境下生长发育良好,无免疫缺陷表型。结论本研究初步建立了在普通环境下可正常生长发育的FOXN1基因敲除兔嵌合体,为后续进一步繁育FOXN1免疫缺陷兔奠定了研究基础。

利用CRISPR/Cas9技术制备ApoE-/-兔

目的制作载脂蛋白E（ApoE）基因敲除（ApoE^（-/-））兔,为研究动脉粥样硬化提供优良动物模型。方法应用CRISPR/Cas9系统编辑新西兰兔的Apo E基因,制作F0代ApoE^（-/-）兔,利用PCR、TA克隆、Sanger测序、Western blot和血脂检测鉴定Apo E靶向敲除的效率和效果,并通过传代获得ApoE^（＋/-）兔。结果 Sanger测序结果显示成功靶向敲除兔ApoE基因,血清脂蛋白含量在正常饮食状态下相对于野生型兔有升高,且可稳定遗传。结论成功建立了ApoE^（-/-）兔,为进一步研究动脉粥样硬化和其他相关疾病提供了良好的动物模型。

利用TALEN系统对兔进行Tiki1基因敲除

【目的】利用转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)系统获得Tiki1基因敲除的兔模型,为研究Tiki1对动物早期发育作用机理提供兔源的动物模型。【方法】基于TALEN系统设计了靶向兔Tiki1基因的打靶载体,分别将10和50 ng/μL的Tiki1-TALEN mRNA注射到原核期的家兔受精卵胞质中,然后收集发育至囊胚期的胚胎,鉴定囊胚率和基因修饰效率,通过测序检验囊胚的基因突变。为了进一步获得Tiki1基因敲除兔,后续将50 ng/μL的Tiki1-TALEN mRNA注射到17个原核期的家兔受精卵胞质中,将受精卵分别移植到2只受体兔体内。【结果】注射50 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA试验组的囊胚率(64%)与注射10 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA试验组的囊胚率(57%)差异不大,但注射50 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA试验组的囊胚基因修饰效率(100%)显著高于注射10 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA试验组的囊胚基因修饰效率(14.3%)。测序结果表明,Tiki1基因的突变范围从1到28 bp缺失不等。经过胚胎移植共生出3只仔兔,其中有2只兔子能检测到基因突变。【结论】所建立的TALEN技术体系可以对家兔Tiki1基因进行高效的敲除。