p53基因敲除小鼠的饲养繁殖及鉴定

目的为了繁育和鉴定p53基因敲除小鼠,将引进的杂合子小鼠进行饲养繁殖,杂合子用于继续保种。方法对其幼鼠剪尾提取基因组DNA,采用PCR方法进行基因型鉴定。结果对引进小鼠已成功饲养和繁殖,并得到纯合基因缺失型小鼠。结论正确的饲养、繁殖及基因鉴定方法对于基因敲除小鼠的获得和保种具有重要的意义。

p53基因敲除对细胞迁移的影响

目的研究p53基因敲除对细胞迁移的影响。方法观察p53+/+和p53-/-细胞中血清诱导的板状伪足形成情况,以及利用Transwell细胞迁移系统观察p53基因敲除对血清诱导的细胞迁移的影响。结果在血清诱导下,p53+/+细胞能形成板状伪足和进行迁移,而p53-/-细胞中板状伪足的形成和细胞迁移都被阻断。结论p53在血清诱导的细胞迁移中具有重要作用。

p53+/-基因敲除小鼠的脏器质量及血液学参数测定

目的测定自主建立的p53+/-基因敲除小鼠的脏器及血液生理生化指标,并比较周龄、性别对各项指标的影响。方法选取4周龄和8周龄的p53+/-基因敲除小鼠各20只,雌雄各半,测定其主要脏器质量及血液生理指标。结果不同周龄和性别的p53+/-基因敲除小鼠部分脏器质量和血生理生化有差异性。4周龄和8周龄小鼠在体质量等这21项指标上都有差异显著性(P<0.01),且在左肾上腺等8项指标上差异存在统计学意义(P<0.05)。4周龄的雌、雄小鼠在RDW、总胆固醇(CHO)这2项指标上差异存在显著性(P<0.01),仅肺这1项指标上差异有统计学意义(P<0.05),其余指标之间无明显差异;而8周龄雌雄小鼠在体质量等16项指标上雌雄间都有显著性差异(P<0.01),在HCT等9项指标上存在差异(P<0.05)。结论本文测定并比较了不同周龄及性别的p53+/-基因敲除小鼠的脏器及血液生理生化指标,为该模型的合理利用及商业化供应提供了背景数据。

大蒜素对apoE^-/-小鼠动脉粥样硬化易损斑块细胞凋亡及P53蛋白表达的影响

目的探讨大蒜素对载脂蛋白E基因敲除(apoE^(-/-))小鼠动脉粥样硬化易损斑块的作用及其机制。方法以高脂饲料喂养apoE~(^(-/-))小鼠8周造模,并随机分为模型组、低剂量大蒜素组和高剂量大蒜素组,每组8只。模型组小鼠给予0.50mL生理盐水灌胃,低剂量大蒜素组给予0.25mL生理盐水+0.25mL大蒜素溶液灌胃,高剂量大蒜素组给予0.50mL大蒜素溶液灌胃,每天1次,连续8周。然后取主动脉根部,采用TUNEL染色检测斑块凋亡阳性面积,采用免疫组化方法检测斑块内凋亡巨噬细胞、血管平滑肌细胞含量及凋亡相关蛋白P53的表达。结果大蒜素灌胃处理后斑块凋亡阳性面积均减小,其中低剂量大蒜素组减小具有统计学意义(F=42.32,P<0.05),高剂量大蒜素组减小差异无统计学意义(P>0.05)。低剂量大蒜素组斑块内凋亡巨噬细胞含量较模型组和高剂量大蒜素组降低,差异具有统计学意义(F=28.13,P<0.05);各组斑块内凋亡血管平滑肌细胞含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。低剂量大蒜素组和高剂量大蒜素组斑块内P53蛋白表达均显著低于模型组,差异有统计学意义(F=22.11,P<0.05)。结论大蒜素可通过下调P53蛋白的表达、抑制细胞凋亡,发挥稳定晚期不稳定斑块的作用。

p53基因敲除大鼠模型的构建及表型分析

使用TALEN技术制作p53基因敲除大鼠模型,建立种群并分析大鼠表型。设计特异性识别p53基因外显子2的TALEN蛋白并构建相应载体,将体外转录的TALEN m RNA注射SD大鼠受精卵,出生后从仔鼠中通过测序筛选靶位点正确剪切的阳性小鼠。结果显示,注射得到11只新生仔鼠,通过测序发现其中有10只靶位点发生剪切。选取其中4只作为首建鼠进行繁殖。p53基因敲除纯合子表现出肿瘤易发性,主要自发性肿瘤类型为恶性纤维组织肉瘤。此外,p53基因敲除纯合子大鼠表现出眼睛发育异常,视网膜变性及晶状体纤维排列紊乱。通过TALEN技术高效地获得了p53基因敲除大鼠模型,纯合子敲除大鼠除了易发肿瘤并伴有眼发育异常,因而该敲除大鼠模型除了可用于研究肿瘤发生机制外,也可用于研究p53基因在眼发育过程中的功能。

B6-Trp53^(tm1)/NIFDC小鼠在MNU给药后的体质量、脏器质量、血液学及血生化指标的测定

目的测定自主建立的p53+/-基因敲除小鼠(B6-Trp53^(tm1)/NIFDC)在N-甲基-N-亚硝基脲(N-Methyl-Nnitrosourea,MNU)给药后体质量、脏器质量、血液学及血生化指标,为临床前药物安全评价致癌性实验短期体内替代试验候选遗传修饰动物模型提供背景性数据。方法共设计4个组:阴性对照组(野生型小鼠)给予生理盐水、溶媒对照组(B6-Trp53^(tm1)/NIFDC小鼠)给予枸橼酸缓冲液、MNU组1(B6-Trp53^(tm1)/NIFDC小鼠)给予75 mg/kg MNU、MNU组2(野生型小鼠)给予75 mg/kg MNU,阴性对照组和MNU组2每组野生型小鼠各20只,雌雄各半,溶媒对照组和MNU组1每组B6-Trp53^(tm1)/NIFDC小鼠各20只,雌雄各半,测定其体质量、主要脏器质量、相对脏器质量、血液学及血生化指标,并进行统计分析。结果 MNU组1、MNU组2动物体质量降低与阴性对照组、溶媒对照组相比都存在显著性统计学差异(P<0.05)。MNU组1、MNU组2动物心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胸腺和颌下腺的绝对质量与阴性对照组、溶媒对照组相比有显著性统计学差异(P<0.05)。MNU组1和MNU组2动物心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、胸腺和颌下腺的相对质量与阴性对照组、溶媒对照组相比有显著性统计学差异(P<0.05)。MNU组1和MNU组2动物均发现NEU、LYM%、LUC%、RBC、HGB、HCT、MCV、MCHC、RDW、HDW、CHCM、CHDW、PDW、MPV及PLT等15个指标与阴性对照组和溶媒对照组相比有显著性统计学差异(P<0.05)。另外,MNU组1和MNU组2均发现TP、ALB、CREA、UREA、TCHO、TG、CA等7个指标与阴性对照组和溶媒对照组有显著性统计学差异(P<0.05),MNU组2的AST与阴性对照组和溶媒对照组有显著性升高(P<0.05),但MNU组1和MNU组2组间没有显著性统计学差异。结论本文测定并分析了自主建立的p53+/-基因敲除小鼠(B6-Trp53^(tm1)/NIFDC)和野生型小鼠分别给予MNU及枸橼酸缓冲液后的体质量、脏器质量、血液学及血生化指标,该模型有望将来用于临床前药物安全评价致癌性实验短期体内替代试验。

p53基因敲除小鼠基因鉴定及肿瘤病理研究

目的:鉴定p53基因敲除(p53-/-)小鼠基因型,分析新生肿瘤的类型。方法:通过剪尾法提取小鼠基因,通过PCR对提取的DNA进行扩增,将扩增的DNA用核酸电泳的方式进行鉴定。同时,对新生的肿瘤进行取材,常规HE染色,镜下观察。结果:基因鉴定结果表明该小鼠为纯合基因缺失型小鼠,所生长的肿瘤为高分化皮肤鳞癌。

Apak稳定敲除细胞系的建立及其p53活性和凋亡水平的变化

目的利用CRISPR/Cas9慢病毒系统在人结肠癌细胞(HCT116细胞)中建立稳定及永久性Apak敲除细胞系,检测Apak敲除后细胞部分生物学活性、p53活性和凋亡水平的变化。方法构建lenti CRISPR v2-sgRNA Apak敲除质粒,进行慢病毒包装,感染HCT116细胞,嘌罗霉素筛选出阳性克隆。通过蛋白质免疫印迹检测Apak蛋白水平,筛选得到Apak稳定敲除细胞系。分别通过报告基因实验、流式细胞术和克隆形成实验测定Apak稳定敲除细胞系中p53活性、细胞凋亡率和克隆形成能力。结果通过测序证明lenti CRISPR v2-sgRNA Apak敲除质粒正确,蛋白质免疫印迹证实Apak敲除细胞系中Apak表达缺失。在Apak敲除细胞系中p53的转录活性增强,Apak敲除细胞凋亡增加、克隆形成能力降低。结论获得Apak稳定敲除细胞系,便于后期Apak功能的研究。