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重组Klenow-HSA融合蛋白的构建、纯化及其稳定性 被引量:2
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作者 曾令娥 黄晶 +3 位作者 白惠卿 范慧 黄大无 王露 《北京大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期684-687,共4页
目的 :提高Klenow酶的热稳定性和储藏稳定性。方法 :利用PCR的方法扩增DH5α染色体DNA ,构建编码Klenow和人血清白蛋白第三功能区 (HSA D3)的融合蛋白表达质粒 ,并在大肠杆菌中获得高效表达。分别对Klenow酶和Klenow HSA融合蛋白进行纯... 目的 :提高Klenow酶的热稳定性和储藏稳定性。方法 :利用PCR的方法扩增DH5α染色体DNA ,构建编码Klenow和人血清白蛋白第三功能区 (HSA D3)的融合蛋白表达质粒 ,并在大肠杆菌中获得高效表达。分别对Klenow酶和Klenow HSA融合蛋白进行纯化 ,并进行活性及稳定性的研究。结果 :发现Klenow HSA融合蛋白在大肠杆菌中呈可溶性表达。体外实验证实这种融合蛋白具有与Klenow聚合酶相同的活性 ,其稳定性明显提高。结论 :融合蛋白确实能增加Klenow酶的热稳定性和储存稳定性 。 展开更多
关键词 DNA聚合酶 I/生物合成 人血清白蛋白 重组融合蛋白质类/生物合成 DNA聚合酶 I klenow片段
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Identification of a gene engineering antibody against cystic echinococcosis in liver
2
作者 Xin-Hua Chen Hao Wen +3 位作者 Yao-Xin Zhang Xiao-Hui Feng Xiao-Mei Lu Dong Ma the Xinjiang Hydatid Clinical Research Institute and the Department of Infectious Diseases First Teaching Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China 《Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International》 SCIE CAS 2003年第3期383-386,共4页
OBJECTIVE: To identify a gene engineering antibody against cystic echinococcosis in liver. METHODS: A single chain of variable fragment of human antibodies (ScFvs) was selected from the library by using affinity selec... OBJECTIVE: To identify a gene engineering antibody against cystic echinococcosis in liver. METHODS: A single chain of variable fragment of human antibodies (ScFvs) was selected from the library by using affinity selection technique with the recombinant antigen on solid surface. The positive clones were demonstrated by ELISA and their DNA sequences were also determined. RESULTS: The DNA sequence data showed that the antibody gene is composed of 768bp. In addition, a specific combination capacity with recombinant Echinococcus granulosus antigen B (r-EgB) was demonstrated by ELISA. CONCLUSION: The obtained gene engineering antibody against r-EgB may have potential implications in immunological treatment and drug targeting delivery. 展开更多
关键词 cystic echinococcosis in liver gene engineering antibody phage display single chain of varlable fragment of human antibody recombinant Echinococcus granulosus antigen B
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一种高效构建同源重组DNA片段的方法——融合PCR 被引量:51
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作者 李敏 杨谦 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第8期53-58,共6页
融合PCR技术(fusion PCR)采用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR产物,通过PCR产物重叠链的延伸,从而将不同来源的任意DNA片段连接起来,此技术在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下实现DNA片段的体外连接,为同源重组片段的构建... 融合PCR技术(fusion PCR)采用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR产物,通过PCR产物重叠链的延伸,从而将不同来源的任意DNA片段连接起来,此技术在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下实现DNA片段的体外连接,为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。对原有的融合PCR技术进行改进,以3个同源重组线性DNA片段的构建为例,详细论述了改进的融合PCR技术的反应过程及技术体系。结果表明,改进的融合PCR技术可以同时进行3个片段及4个片段的融合反应,产物长度均在4.5kb以上,各同源重组片段在扩增过程中均无突变发生,获得的片段可以用于后续实验分析。 展开更多
关键词 融合PCR 重组片段 同源臂 抗性基因
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In-fusion连接技术优化及其在大片段重组载体构建中的应用 被引量:3
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作者 李玲玲 张伟 +3 位作者 宋玲珍 胡新德 陈树林 赵善廷 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第5期1-7,共7页
随着大规模基因组测序的完成和表达序列标签数据库的建立,基因组的研究已由结构基因组向功能基因组转化,而基因功能研究的关键是基因融合技术。为高效率高保真地构建融合大片段的重组载体,本试验利用In-fusion技术进行大片段载体构建,... 随着大规模基因组测序的完成和表达序列标签数据库的建立,基因组的研究已由结构基因组向功能基因组转化,而基因功能研究的关键是基因融合技术。为高效率高保真地构建融合大片段的重组载体,本试验利用In-fusion技术进行大片段载体构建,以不同的融合时间进行比较,通过细胞转染以及免疫印迹等方法对载体质量进行验证。通过对体系中连接时间的优化,构建出了含插入片段10、8、4ku的真核表达载体,并可正确表达。In-fusion技术的优化,提高了大片段真核表达载体构建的效率,为研究大片段基因的生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 基因融合 In—fusion 大片段PCR扩增产物 优化 重组载体
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用部分补平法克隆乙型肝炎病毒preS/S基因 被引量:2
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作者 刘定燮 李德祥 骆抗先 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2001年第1期60-61,共2页
目的探讨利用Klenow大片段对DNA末端作部分补平而使非匹配粘端形成匹配粘端的可行性。方法用 BamHI、XbalI消解载体 pcDNA3,用 BglH、Hind Ⅲ从含乙型肝炎病毒全基因组质粒中切取 HBVpreS/... 目的探讨利用Klenow大片段对DNA末端作部分补平而使非匹配粘端形成匹配粘端的可行性。方法用 BamHI、XbalI消解载体 pcDNA3,用 BglH、Hind Ⅲ从含乙型肝炎病毒全基因组质粒中切取 HBVpreS/S基因片段。 pcDNA3的 XbalI及 preS/S基因的 Hind Ⅲ切口端经 Klenow大片段作部分补平后形成二碱基的互补粘端。连接修饰 后的preS/S基因片段与pcDNA3并转化后筛选阳性克隆。结果限制性内切酶分析显示preS/S基因被定向克隆于载 体pcDNA3的预定位点。结论部分补平法是连接非匹配DNA粘性末端的较好选择。 展开更多
关键词 基因重组 klenow大片段 乙型肝炎病毒 部分补平法 克隆 preS/S基因
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模式抗原破伤风毒素C蛋白的克隆、表达条件优化及免疫原性初步分析 被引量:1
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作者 王明永 张雅妮 +3 位作者 雷鸣 左大明 张丽芸 陈政良 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期731-735,共5页
目的获得高纯度、高免疫原性的破伤风毒素C片段(TTC)蛋白。方法以PCR从破伤风杆菌质粒DNA中扩增TTC基因片段,将其插入载体pET43.1a(+)并导入大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达。用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化融合蛋白,经凝血酶酶切,再用Ni2+-NTA... 目的获得高纯度、高免疫原性的破伤风毒素C片段(TTC)蛋白。方法以PCR从破伤风杆菌质粒DNA中扩增TTC基因片段,将其插入载体pET43.1a(+)并导入大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达。用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化融合蛋白,经凝血酶酶切,再用Ni2+-NTA琼脂糖柱分离目的蛋白。SDS-PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的相对分子质量和抗原性,动物免疫实验鉴定其免疫原性。结果获得1373bp的TTC基因片段,构建成重组表达载体pET43.1a(+)-TTC并在大肠杆菌中表达。TTC-Nus融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的22%,酶切后TTC蛋白可与载体蛋白有效分离,获得纯度为95.5%的TTC蛋白,该蛋白可被破伤风抗毒素识别;将TTC蛋白免疫小鼠后,免疫血清可与破伤风毒素特异性结合,三次免疫后其抗体效价可达1∶25600。结论所获TTC蛋白纯度高,免疫原性好,为研究体内外抗原提呈、免疫应答提供了良好的模式抗原。 展开更多
关键词 破伤风毒素C蛋白 基因克隆 重组表达 免疫原性 模式抗原
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玉米DNA限制性片段长度多态(RFLPs)的研究 被引量:2
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作者 季良越 罗福和 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 1993年第2期120-126,共7页
文章简要介绍了10余年来有关玉米DNA限制性片段长度多态(RFLPs)的研究,说明RFLP的分析原理和特点,构建玉米RFLP连锁图的方法,以及玉米RFLPs在遗传育种中的主要应用。
关键词 杂交 数量性状 遗传 玉米
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利用套叠PCR技术合成人胰岛素原基因的临床研究
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作者 马建忠 周贤婧 王永刚 《中国现代医药杂志》 2010年第2期8-11,共4页
目的设计并分子克隆适宜于大肠杆菌表达系统的人胰岛素原基因。方法以美国国家基因库(GenBank)发布的人胰岛素原的氨基酸序列为模板,参考大肠杆菌表达系统的密码子偏好性以及所用表达载体(pGEX-3x)的特点,经计算机分析、设计人胰岛素原... 目的设计并分子克隆适宜于大肠杆菌表达系统的人胰岛素原基因。方法以美国国家基因库(GenBank)发布的人胰岛素原的氨基酸序列为模板,参考大肠杆菌表达系统的密码子偏好性以及所用表达载体(pGEX-3x)的特点,经计算机分析、设计人胰岛素原基因为8个寡核苷酸片段,以重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术体外延伸获得完整的人胰岛素原基因,分子克隆后测定所得基因的核苷酸序列。结果经限制性内切酶分析确定为重组克隆的质粒进行核苷酸序列分析,结果表明,我们所克隆的基因序列完全符合我们先前的设计。结论SOE-PCR技术可用于体外寡核苷酸片段的延伸并获得完整长度的基因。TaqDNA聚合酶延伸反应前以Klenow片段处理可提高较短覆盖末端或较低专一性末端正确延伸的成功率。 展开更多
关键词 套叠PCR(SOE-PCR) 人胰岛素原 klenow片段 基因克隆
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PGL3-DF3-DTA在DF3阳性人乳腺癌细胞移植瘤中的表达和作用
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作者 张杨 黄文广 +1 位作者 黄汉菊 杨琰 《中国普通外科杂志》 CAS CSCD 2008年第5期454-457,共4页
目的探讨含人乳癌DF3/MUC1启动子转录调控序列的DTA重组表达载体PGL3-DF3-DTA对乳腺癌DF3阳性癌细胞的选择性表达和杀伤作用。方法将乳腺癌的两种细胞株MCF-7和MDA-MB-231分别接种于裸鼠背侧皮下,7 d后开始用重组的质粒进行活体内瘤注... 目的探讨含人乳癌DF3/MUC1启动子转录调控序列的DTA重组表达载体PGL3-DF3-DTA对乳腺癌DF3阳性癌细胞的选择性表达和杀伤作用。方法将乳腺癌的两种细胞株MCF-7和MDA-MB-231分别接种于裸鼠背侧皮下,7 d后开始用重组的质粒进行活体内瘤注射治疗。肿瘤接种后第29天脱颈椎处死裸鼠,测量移植瘤的体积和质量;并采用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测裸鼠移植瘤内DTA的表达情况。结果重组表达载体PGL3-DF3-DTA在MCF-7细胞株移植瘤中表达,明显抑制肿瘤生长。结论重组表达载体PGL3-DF3-DTA对乳腺癌DF3阳性的癌细胞起到了选择性表达和杀伤作用。 展开更多
关键词 乳腺肿瘤 DF3/MUCI 重组质粒 DTA 基因治疗
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Further evidence for paternal DNA transmission in gynogenetic grass carp 被引量:2
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作者 Zhuangwen Mao Yeqing Fu +5 位作者 Shi Wang Yude Wang Kaikun Luo Chun Zhang Min Tao Shaojun Liu 《Science China(Life Sciences)》 SCIE CAS CSCD 2020年第9期1287-1296,共10页
Gynogenesis is an important breeding method in aquaculture and has been widely applied to many fish species.If gynogenetic progenies are to inherit paternal partial genomic DNA,this will increase genetic variation and... Gynogenesis is an important breeding method in aquaculture and has been widely applied to many fish species.If gynogenetic progenies are to inherit paternal partial genomic DNA,this will increase genetic variation and will provide a useful outcome for breeding.In this study,we investigated the genetic variation in homeobox(Hox)gene clusters(Hox A4 a,Hox A9 a,Hox A11 b,Hox B1 b,Hox C4 a,Hox C6 b,and Hox D10 a)among koi carp(Cyprinus carpio haematopterus,KOC;the stimulation sperm source),grass carp(Ctenopharyngodon idellus),and gynogenetic grass carp(GGC).We found paternal DNA(a special DNA fragment and Hox C6 b)derived from KOC and a recombinant gene belonging to Hox C6 b in GGC.We are the first to report the recombinant Hox C6 b in GGC.Our study provides further evidence for paternal DNA transmission to gynogenetic progenies,which is a finding with great significance for the genetic breeding of fish. 展开更多
关键词 Ctenopharyngodon idellus Cyprinus carpio haematopterus GYNOgeneSIS Hox genes DNA fragment recombinant gene
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铜绿假单胞菌中快速基因操作工具的开发和应用
11
作者 李飞旋 倪磊 金帆 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期1789-1803,共15页
针对基因的操作,包括缺失和插入基因、替换基因元件(如启动子)、融合荧光蛋白基因、构建原位的基因报告系统,是大多数生物技术实验室的必备技术。目前广泛使用的基于2次同源重组的基因操作方法,在构建质粒、转化和筛选方面较为繁琐。另... 针对基因的操作,包括缺失和插入基因、替换基因元件(如启动子)、融合荧光蛋白基因、构建原位的基因报告系统,是大多数生物技术实验室的必备技术。目前广泛使用的基于2次同源重组的基因操作方法,在构建质粒、转化和筛选方面较为繁琐。另外使用该方法进行长片段敲除的效率较低。为了简化基因操作的流程,本研究构建了一个最小化的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)整合型质粒pln2,只需将目标基因内部一段序列克隆到pln2质粒并导入细菌,由于质粒不能在细菌内自我复制而只能通过单次等位基因交换整合到基因组上,从而使目的基因断裂为两部分而失去活性。在pln2的基础上开发了一整套工具质粒适用于基因组的不同操作,包括融合荧光蛋白基因、替换基因元件(如启动子)、构建原位的转录型荧光报告系统。此外,本研究借助该系统成功实现超长片段基因簇的敲除,单次可以敲除长达270 kb的片段。 展开更多
关键词 基因操作 单交换同源重组 铜绿假单胞菌 长片段敲除 新技术与新方法
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牛环形泰勒虫诊断性靶基因片段的筛选及鉴定
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作者 曹雯丽 林涛 +3 位作者 郭庆勇 王冰洁 张杨 巴音查汗 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第12期1231-1235,共5页
通过对牛环形泰勒虫Tams1基因的不同片段进行克隆表达,以期得出该基因疏水区对蛋白表达的影响及筛选的目的蛋白作为ELISA抗原的特异性。利用3对不同的特异性引物对Tams1基因的三段区域(全长基因、无N端及C端疏水区、仅缺乏N端的疏水区)... 通过对牛环形泰勒虫Tams1基因的不同片段进行克隆表达,以期得出该基因疏水区对蛋白表达的影响及筛选的目的蛋白作为ELISA抗原的特异性。利用3对不同的特异性引物对Tams1基因的三段区域(全长基因、无N端及C端疏水区、仅缺乏N端的疏水区)进行克隆,最终构建三种重组表达载体。经电泳分析筛选获得可溶性表达重组质粒,目的蛋白经亲和层析纯化后进行Western-blot分析。结果显示,在37℃条件下,经终浓度为1mmol/L IPTG诱导表达4h后,无疏水区的靶重组质粒表达出53ku的可溶性蛋白,其表达量达1.39mg/mL;而含全长基因或C端疏水区的质粒分别表达55ku、56ku的包涵体蛋白。Western-blot分析结果表明,筛选得到的可溶性蛋白能被环形泰勒虫阳性血清特异性识别,具有良好的反应原性。结果表明,该蛋白可作为潜在的进行牛环形泰勒虫病流行病学调查的候选抗原。 展开更多
关键词 牛环形泰勒虫 Tams1基因片段筛选 重组质粒 可溶性蛋白
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两步PCR介导的Red重组技术快速敲除鼠疫耶尔森菌sRNA及染色体大片段 被引量:4
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作者 王仁霞 刘荣娇 +4 位作者 李子微 王瑞欢 杨瑞馥 韩延平 邓仲良 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期1126-1137,共12页
【目的】利用Red同源重组系统,通过二步PCR法建立一种适合鼠疫耶尔森菌s RNA和大片段染色体基因敲除的方法。【方法】第一步PCR先扩增出目的基因的上、下游同源臂(600–1000 bp)及卡那抗性盒,再以上、下游同源臂及卡那抗性盒等摩尔混合... 【目的】利用Red同源重组系统,通过二步PCR法建立一种适合鼠疫耶尔森菌s RNA和大片段染色体基因敲除的方法。【方法】第一步PCR先扩增出目的基因的上、下游同源臂(600–1000 bp)及卡那抗性盒,再以上、下游同源臂及卡那抗性盒等摩尔混合物为模板,通过融合PCR获得含上下游同源臂及卡那抗性盒的线性突变盒,再将此突变盒的PCR产物电转到含有pKD46质粒的鼠疫201菌株,在阿拉伯糖的诱导下,p KD46质粒表达Red重组酶,促使卡那抗性盒替换目的基因,最后对获得的重组克隆进行PCR鉴定。【结果】本研究通过两步PCR法构建600–1000 bp的同源臂,提高了同源重组效率,并将鼠疫菌sRNA RyhB1(108 bp)和RyhB2(106 bp)和染色体大片段47-2(10.4 kb)、47-3(21.6 kb)、47-3a(9.2 kb)及47-3b(6.1 kb)成功敲除。【结论】基于Red重组系统构建的二步法突变技术,是一种简单、高效的精确修饰鼠疫菌s RNA及大片段染色体的方法,适合于鼠疫菌全基因组的基因敲除,为鼠疫菌基因表达与调控、致病和毒力等研究提供有力的工具。 展开更多
关键词 鼠疫耶尔森菌 RED重组系统 SRNA 大片段染色体 基因敲除
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