DNA损伤效应主动监测的抗氧化基因缺失微生物传感器的构建及性能评价

目的活性氧基团(ROS)水平升高会引起生物体的DNA氧化损伤,监测DNA的氧化损伤程度,能够实现ROS损伤效应的有效评价。基于微生物传感器监测DNA损伤效应可以定量评价氧化损伤程度,但微生物本身具有的ROS清除机制,会影响监测灵敏度。本研究旨在敲除细菌ROS清除机制的关键基因,构建抗氧化基因缺失微生物传感器,实现对DNA损伤效应的灵敏监测,评价ROS对生物体的损伤效应。方法本研究基于λ-Red同源重组的方法敲除细菌抗氧化损伤相关基因ahpCF、katE与katG,构建抗氧化基因缺失微生物传感器,并评价传感器对萘啶酮酸钠和紫外照射的响应。结果成功构建ΔahpCF、ΔahpCF/ΔkatE与ΔahpCF/ΔkatE/ΔkatG三种抗氧化基因缺失的微生物传感器,工程菌ΔahpCF/ΔkatE/ΔkatG对DNA损伤试剂萘啶酮酸钠的响应灵敏度最高,检测限为0.40μmol/L,另外,1.80 min的紫外照射(254 nm)可诱导工程菌产生显著的荧光表达效应。结论本研究构建了抗氧化基因缺失微生物传感器,实现了对DNA损伤试剂和紫外照射等DNA损伤效应的主动灵敏监测,可为未来空间辐射效应的评价提供一种主动、有效、灵敏的潜在监测方法。

一步法制备荧光开启传感器检测BRCA2

筛查乳腺癌易感基因2(BRCA2)基因突变对于乳腺癌患病风险评估、发病检测、早期诊断及基因治疗均具有重要临床意义。现有乳腺癌基因传感检测方法大多需要复杂的处理过程,成本较高且对单碱基突变识别能力较弱。为简化基因传感器制备过程,提高其应用可能性,文章通过DNA分子发夹结构设计,一步实现了BRCA2的检测。其中分子发夹茎部含BRCA2互补序列,茎与环连接处标记四甲基罗丹明荧光基团(TAMRA),环部5个G碱基通过光诱导电子转移猝灭部分荧光信号,降低背景荧光信号;待测BRCA2序列与发夹茎部序列竞争结合,发夹结构被打开,荧光信号上升,测量上升的荧光信号强度即可实现一步法定量检测靶基因。优化实验结果表明,分子发夹浓度不同时,传感器检测范围不同。当分子发夹浓度为150 nmol·L^(-1)时,对BRCA2的线性检测区间为1~50 nmol·L^(-1);浓度为300和600 nmol·L^(-1)时,线性检测区间分别为1~100和1~200 nmol·L^(-1)。三种浓度传感器检出限分别为0.54、0.72和1.81 nmol·L^(-1)。此外,传感器对BRCA2的特异性检测较为突出,尤其对单碱基突变的识别能力较强。该方法制备与检测过程简单且特异性突出,不仅可用于乳腺癌高危人群的早期筛查,还可拓展应用于其他种类的基因检测,为基因传感器的推广应用提供一种制备简单、操作便捷的新方法。

快速提取细菌DNA方法的研究

目的:研究快速、有效可以应用于压电基因传感器对病原微生物的快速检测的DNA的提取方法。方法:采用沸水浴法,酚、氯仿法,chelex1 0 0法和试剂盒法提取金黄色葡萄球菌ATCC2 5 92 3、铜绿假单胞菌ATCC 2 785 3和大肠杆菌ATCC 2 5 92 2的DNA对产物进行纯度和产量测定,并对1 6SrDNA区域利用通用引物进行扩增。初步应用自行研制的压电基因传感器检测金黄色葡萄球菌ATCC2 5 92 3的PCR产物。结果:除沸水浴法,其他3种方法均能抽提出3种细菌的DNA与1 0 0法和酚、氯仿法抽提产物的纯度和产量差异无显著性(P >0 .0 5 ) ,但chelex1 0 0法操作更为简单、成本低;试剂盒法抽提出的产物纯度和产量明显高于酚、氯仿法、chelex1 0 0法P <0 . 0 5 ) ,但成本高,操作繁琐。结论:chelex1 0 0法操作简便、省时、成本低,适宜用于压电传感器样本的预处理。

探针浓度值对LSAW-bisPNA传感器检测系统的影响

目的探讨双体肽核酸(bisPNA)探针浓度值对漏声表面波(LSAW)-bisPNA基因传感器检测系统的影响。方法LSAW基因传感器表面分别固定终浓度为0.001、0.005、0.01、0.05、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0μmol/L的bisPNA探针后,分别观察其与相应的HPV靶序列杂交时相位变化及反应所需时间。结果与HPV靶序列杂交所引起的相位变化值是先升后降,以1.0μmol/L探针浓度为分界线;杂交平衡时间上各组间未见明显的变化趋势。结论1.0μmol/L bisPNA探针固定浓度最为适宜。

压电基因传感器检测巨细胞病毒PCR产物的实验研究

目的 应用自行研制的压电基因传感器检测巨细胞病毒临床标本的PCR产物 ,探讨压电传感器检测核酸反应的可行性以及各种影响因素。方法 设计特异性DNA探针巯基法固定于传感器晶振表面并调节谐振频率在液相中稳定性达到± 1Hz ,定量加入 65份巨细胞病毒临床标本的PCR产物并观察核酸反应导致的频率变化情况 ,并与PCR产物的电泳结果作对照。结果 加入HCMVPCR阳性产物的传感器谐振频率明显下降 ,3 8例阳性产物的平均频率下降值为73 66Hz ,阴性产物的频率没有变化。与PCR电泳结果的阳性符合率为 86 8%,阴性符合率为 93 10 %。

组合靶基因自动检测仪应用软件的设计

目的 研制与开发组合靶基因自动检测仪应用软件。方法 应用VB6 .0编程语言及Access 97数据库实现压电石英谐振频率的实时检测与分析。结果 实现了组合靶基因自动检测仪压电石英谐振频率的实时检测、数据分析、结果保存与数据转换等。结论 组合靶基因自动检测仪应用软件是一类可实时检测与分析压电石英谐振频率的新型实用性软件 ,可广泛应用于压电石英谐振频率的检测。

基因传感技术及目前存在的问题和发展对策

对最近几年报道的比较有特色的光学、压电、电化学等基因 ( DNA)传感器方面的研究工作进行介绍 ,并就目前基因传感器研究中存在的问题进行了分析讨论 ,提出了相应的发展对策 .

缓冲液离子浓度对新型PNA-LSAW基因传感器杂交效应的影响

目的探讨PBS缓冲液的离子浓度对构建的肽核酸(PNA)漏声表面波(LSAW)基因传感器杂交效应的影响。方法将1.0μmol/L的PNA探针固定在LSAW基因传感器表面,分别加入10、20、50、100mmol/L的PBS缓冲液,观察不同离子浓度的PBS缓冲液对PNA-LSAW基因传感器杂交效应的影响,记录分析传感器相位的变化值及反应所需的时间。结果当钠离子浓度从10mmol/L增加至100mmol/L时,传感器的相位变化呈先升高后降低的趋势,以20mmol/L为分水岭。而杂交平衡时间增加显著。结论离子浓度极大地影响了杂交反应的时间,低盐离子浓度更有利于提高PNA和靶序列的杂交速率,高盐离子浓度则会大大降低PNA的结合速率。离子浓度为20mmol/L时杂交最为适宜。

石英谐振传感器液相稳定平台构建及检测HCMV的实验研究

目的 建立石英谐振压电基因传感器检测系统液相稳定平台并应用该检测系统实时检测链置换扩增(Stranddisplacement amplification,SDA)反应。方法①观察以金属夹具式和粘胶式两种检测池连接方式构成的传感器在液相中的频率稳定性;②以巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)为检测对象,建立SDA反应系统;③传感器检测系统对HCMVSDA反应进行实时检测。结果①新型金属夹具式可调节及可换式传感器检测池可实现传感器在液相中的频率稳定性;②SDA反应可引起压电基因传感器的频率持续下降;③在一定范围内核酸杂交所引起的频率下降幅度随加入的靶序列浓度提高而增大。结论 成功构建压电基因传感器液相检测稳定平台并实现对SDA反应的实时检测;该系统可直接检测基因组DNA并可广泛应用于病原微生物的临床检测。

压电基因传感器检测芽孢杆菌靶序列研究

在石英晶体微天平（QCM）上用生物素-亲和素法和自组装法2种不同的方法固定寡核苷酸探针，构建压电基因传感器，对芽孢杆菌靶序列进行实时检测。结果表明：生物素一亲和索法固定探针效果更好，靶序列浓度为0．05-0．5μmol／L时，有很好的线性关系，线性回归方程为Y=93．88X＋10．88（R=0．9890，N=6，P〈0．001），非线性误差为±4．7％。该传感器特异性较好，能够识别错配3个碱基的序列。

“RecA蛋白-互补单链DNA探针”生物信号放大系统用于压电基因传感器的研究

目的 利用“RecA蛋白 互补单链DNA探针”与固定的肽核酸 (bis PNA)探针相结合 ,摸索最适的液相反应条件 ,以提高压电基因传感器基因传感表面的质量负载 ,从而提高传感器的灵敏度。方法 基因传感器阵列固定上针对乙肝病毒的bis PNA探针 ,加入靶DNA与之反应 ,然后加入预先处理过的不同浓度 (0 .5～ 6mg/ml)的“RecA蛋白 互补单链DNA探针”。结果 当RecA蛋白浓度为 3mg/ml时 ,ATPγS浓度为 1 2 .5 μM ,所引起的频率变化最显著。 结论 在反应体系中加入“RecA蛋白 互补单链DNA探针” 。

缓冲液pH值对LSAW-bisPNA传感器检测系统的影响

目的探讨PBS缓冲液pH值对LSAW-bisPNA基因传感器检测系统的影响。方法LSAW-bisPNA基因传感器表面固定终浓度为1.0μmol/L的bis-PNA探针,然后分别在pH5.8～8.0的PBS缓冲液中和相应的靶序列杂交,记录相位变化及反应所需时间。结果在不同pH值缓冲液中,bis-PNA与靶序列反应引起的相位变化有明显差异(P<0·01),pH6.6与pH6.8时传感器响应信号最大,但两者反应所达到的平衡时间有明显差异(P<0·05),pH值6.6时检测所需时间更短。结论选择pH6.6作为bis-PNA和靶序列dsDNA反应的最适pH值,在该pH值条件下传感器响应信号大,反应达平衡时间短。

探针浓度对肽核酸石英谐振式基因传感器阵列杂交效应的影响

目的 探索不同肽核酸 (PNA)探针浓度对PNA石英谐振式基因传感器阵列杂交效应的影响。方法 石英谐振式基因传感器阵列表面分别固定上 0 .0 0 5、0 .0 1、0 .0 5、0 .1、0 .5、1 .0、1 .5、2 .0、4 .0 μM的bis PNA探针后 ,观察其固定以及与相应的HBV靶序列杂交时频率的下降值及反应所需的时间。结果 探针固定引起的频率变化值先升而后趋于平缓 ,而与HBV靶序列杂交所引起的频率变化值却是先升后降 ,以 1 .5 μM探针浓度为分界线 ;杂交平衡时间上各组间未见明显的变化趋势。 结论 1 .5μMbis

离子浓度对肽核酸压电基因传感器杂交效应的影响

目的 探索不同离子浓度的PBS缓冲液对肽核酸压电基因传感器阵列杂交效应的影响。方法 压电基因传感器阵列表面固定上 1 .5 μM的bis PNA探针后 ,分别观察在 1 0、2 0、5 0、1 0 0mM的PBS缓冲液环境中与相应的靶序列杂交 ,记录频率的下降值及反应所需的时间。结果 钠离子浓度从 1 0mM增加至 2 0mM时 ,杂交导致的频率下降值及平衡时间均增加 (P <0 .0 5 ) ;从 2 0mM增加至 5 0、1 0 0mM时 ,杂交导致的频率下降值各组间无显著差异 ,但杂交平衡时间却呈倍数增长。结论 离子浓度极大地影响了杂交反应的时间 ,低盐离子浓度更有利于提高bis PNA和dsDNA的杂交速率 ,高盐离子浓度则会大大降低bis PNA的结合速率。

乙型脑炎病毒靶序列浓度对LSAW基因传感器检测系统的影响

目的探讨乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)靶序列浓度值对漏声表面波(LSAW)基因传感器检测系统的影响。方法LSAW基因传感器表面固定终浓度为0.5μmol/L的JEV探针,然后用pH7.6的10mmol/L PBS缓冲液(含Na+0.3mol/L)中和终浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0μmol/L的JEV靶序列杂交,分别记录相位变化及反应所需时间。结果与JEV探针反应引起的相位变化是先缓慢上升后趋于缓和的趋势,以1.0μmol/L靶序列浓度为分界线;杂交平衡时间上除0.05μmol/L的时间短以外,其他的未见明显变化趋势,当靶序列浓度为1.0μmol/L,杂交反应平衡时间为33min。结论随着靶序列浓度的升高,杂交反应引起的相位变化呈典型的饱和曲线趋势;靶序列浓度为1.0μmol/L、杂交反应的平衡时间为33min,是LSAW基因传感器杂交的最适反应条件。

压电基因传感器在HCMV链置换扩增实时检测中的实验研究

目的 探讨自行研发的压电基因传感器对链置换扩增 (SDA)的实时检测。方法 以巨细胞病毒 (HCMV)为检测对象 ,建立成熟的 SDA反应系统 ;在自行研发的压电基因传感器检测仪上对巨细胞病毒 SDA反应进行实时检测。结果 SDA反应可引起压电基因传感器的频率持续下降 ;在一定范围内核酸杂交所引起的频率下降幅度与加入的靶序列浓度呈正相关 ;加样时温差等因素对早期频率变化曲线的影响不可忽视 ;实验温度是影响SDA压电基因传感器检测灵敏度的重要因素。结论 自行研发的压电基因传感器可成功实现对 SDA反应的实时检测 ;该系统可直接检测基因组 DNA并可广泛应用于病原微生物的临床检测。

压电基因传感芯片的研制

使用微电子技术构建了微石英晶体阵列芯片,并研究了相关的硬件。检测了压电基因传感芯片在气相和液相中的稳定性。实验中,频率稳定,在气相中可达到±2 Hz,液相中达到±4 Hz。可以得出,压电基因传感芯片达到了实际应用要求。

乳腺癌化疗敏感基因研究进展

化疗是乳腺癌常用的治疗手段之一,但由于肿瘤发生机制不同,患者对化疗药物的敏感性存在差异。目前尚未发现实体肿瘤特异化疗敏感基因,但很多与肿瘤增殖、凋亡有关的基因与肿瘤细胞对化疗药物的敏感性有关。本文通过对近几年化疗敏感基因的研究进行综述,来探讨人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)、拓扑异构酶Ⅱα(topoisomeraseⅡα,Top-Ⅱα)、乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene,BRCA1)、p53、细胞凋亡促进基因Bax、LATS2(argetumor supprensor gene)和21-基因复发风险评估系统(the 21-gene recurrence score as-say)等基因用于临床指导化疗的意义和作用。

DNA传感器应用研究进展

DNA传感器以DNA为敏感元件 ,通过换能器将DNA与DNA、DNA与RNA及DNA与其它有机无机离子之间的作用的生物学信号转变为可检测的光、电、声波等物理信号。近年来 ,DNA传感器在基因诊断、环境监控。

利什曼原虫DNA压电晶体传感器的初步研究

目的 研制利什曼原虫DNA压电晶体传感器。方法 对压电石英晶体表面进行处理并结合上探针DNA制成DNA传感器 ,在不同的杂交时间和杂交浓度条件下测定其频率响应。结果 在 5h内随着杂交时间的增加 ,压电晶体振荡频率的改变值△f也呈线性增加 ,在相同的杂交时间内 ,低浓度范围△f随被测DNA浓度的增加而增加。结论 在一定条件下 。