转基因番茄防龋疫苗急性和亚慢性毒性试验

为评价表达致龋变异链球菌表面蛋白和霍乱毒素B亚单位的转基因番茄防龋疫苗的安全性,进行了大鼠经口灌胃染毒试验。结果表明,急性毒性试验中大鼠均未见毒性症状,急性毒性LD50>20 g/kg;亚慢性毒性试验中大鼠均未见毒性症状,在血液学和生化、脏器系数和组织病理学检查中,试验组大鼠与阴性对照组间均无显著差异(P>0.05)。说明,表达致龋变异链球菌表面蛋白和霍乱毒素B亚单位嵌合体蛋白的转基因番茄防龋疫苗对大鼠安全。

表达嵌合体蛋白PAcA/CTB的转基因番茄口服免疫大白兔的实验研究

目的:观察表达嵌合体蛋白PAcA/CTB转基因番茄防龋疫苗的免疫原性和免疫反应性。方法:新西兰大白兔随机分为实验组、阴性对照组和阳性对照组3组,分别喂食3个剂量(目的蛋白量相差1.5倍)的转基因番茄汁、非转基因番茄汁和变异链球菌灭活全菌疫苗。每周免疫1次,连续免疫4周,ELISA法检测免疫前和免疫后不同时期血液、唾液样品中抗变异链球菌PAc的IgG、IgA抗体效价。结果:口服免疫后实验组与阳性对照组大白兔血液和唾液中均出现特异性的抗PAc抗体,抗体水平可维持数周,而阴性对照组抗体水平变化不明显。结论:表达嵌合体蛋白PAcA/CTB的转基因番茄能够诱导动物机体产生有效的系统免疫应答和黏膜免疫应答。

变形链球菌葡糖基转移酶真核表达质粒pcDNA3-gtfB的构建

目的 :构建变形链球菌葡糖基转移酶真核表达质粒pcDNA3_gtfB ,为以其作为基因疫苗进行免疫动物实验奠定物质基础。方法 :以变形链球菌GS_5全染色体DNA为模板 ,通过PCR方法扩增获得含有多个编码变形链球菌葡糖基转移酶抗原表位的目的基因gtfB ,将分离纯化的目的基因和质粒pcDNA3用KpnⅠ、XhoⅠ双酶切 ,酶切产物在T4DNA连接酶作用下进行体外重组 ,用改良Hanahan法转化感受态大肠杆菌JM10 9,采用氨苄青霉素抗性LB平板初步筛选阳性克隆子后 ,抽提重组质粒 ,进行酶切鉴定 ,DNA序列测定。结果 :经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计相同 ,并定向插入真核表达载体pcDNA3 ,插入相位正确 ,未改变目的基因的阅读框架。结论 :真核表达质粒pcDNA3_gtfB含有多个葡糖基转移酶免疫显性抗原表位编码基因 ,且选用的高表达真核表达载体pcDNA3 ,能直接激活抗原提呈细胞 ,可以使重组质粒pcDNA3_gtfB具有较强的免疫原性和免疫反应性 ,为利用其作为基因疫苗防龋奠定了基础。

防龋基因疫苗pcDNA3-PAc不同途径免疫BALB/c小鼠的实验研究

目的:观察防龋基因疫苗pcDNA3-PAc经不同途径免疫BALB/c小鼠后的免疫效果。方法:重组质粒pcDNA3-PAc经颌下腺区皮下注射、股四头肌注射和鼻腔黏膜滴注免疫BALB/c小鼠,共免疫2次,每次间隔2周。分别于首次免疫前1d和免疫后第1、2、4周采集血液和唾液样品,采用酶联免疫吸附方法检测血清特异性IgG抗体和唾液特异性IgA抗体。结果:各实验组免疫后1周血清和唾液中特异性抗体水平开始升高,第4周时达最高水平。颌下腺区皮下注射免疫产生的唾液IgA和股四头肌注射免疫诱导的血清IgG抗体水平明显高于其它实验组(P<0.05)。颌下腺区皮下注射免疫和鼻腔黏膜滴注免疫可诱导较高水平的唾液IgA和一定水平的血清IgG;股四头肌注射免疫诱导的血清特异性IgG抗体水平较高(P<0.05),而唾液IgA抗体水平不如颌下腺区皮下注射免疫和鼻腔黏膜滴注免疫(P<0.05)。结论:防龋基因疫苗pcDNA3-PAc能够诱导动物机体产生有效的系统免疫应答和黏膜免疫应答。

表达嵌合体蛋白PAcP/CTB的转基因番茄免疫BABL/c小鼠的实验研究

目的:观察表达变异链球菌表面蛋白PAcP和霍乱毒素B亚单位融合蛋白(PAcP/CTB)的转基因番茄的免疫原性和安全性。方法:取24 d龄BABL/c小鼠18只,随机分成3组(n=6),分别用转基因番茄果汁(实验组)、变异链球菌灭活全菌(阳性对照组)、非转基因番茄果汁(阴性对照组)灌胃免疫,共4次,每次间隔1周;于首次免疫前1 d和每次免疫后1周称体质量,采集血清、唾液样品,用ELISA法检测血清中IgG、唾液中SIgA抗体水平;最后1次采样后处死所有动物,取心、肝、脾、肺、肾进行组织病理检查。结果:免疫后,实验组和阳性对照组小鼠血清特异性IgG和唾液特异性SIgA水平均明显升高,与阴性对照组相比P<0.05;各组小鼠免疫前后的体质量变化均无统计学差异(P﹥0.05);组织病理学检查,实验组心、肝、脾、肺、肾均未见明显异常。结论:转基因番茄表达的外源目的蛋白PAcP/CTB具有免疫原性和一般安全性。

DNA防龋疫苗诱导长期免疫反应及机制初探

目的:观察编码pac结构基因A-P片段的重组质粒pCIA-P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射(TSG)两种途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应,并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法:将20只BALB/c小鼠随机分为4组,分别以重组质粒pCIA-P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA-P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc的表达。结果:颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高,并持续24周以上。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高,但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论:DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期黏膜免疫的有效途径。

含变链菌SBR基因的双启动子质粒pCN-SSIE的构建及其免疫原性检测

目的:构建含有编码变形链球菌致龋毒力因子SBR基因的双启动子防龋DNA疫苗pCN-SSIE,以减毒沙门菌为载体进行高效黏膜免疫。方法:通过PCR扩增编码变形链球菌表面蛋白抗原的唾液结合区段(SBR)基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,将SBR基因插入到双启动子表达载体pCMVnir中,在SBR基因上游和下游依次插入人工合成的tPA信号肽基因序列、核糖体内部进入位点(IRES)基因和EGFP基因,构建质粒pCN-SSIE。通过DNA测序和酶切分析证明,双启动子表达质粒pCN-SSIE构建成功后,再用该质粒转化减毒沙门菌SL3261和转染CHO细胞,检测SBR在原核细胞和真核细胞中的表达状况,最后用pCN-SSIE裸质粒通过肌内注射免疫小鼠,检测其血清中的抗SBR特异抗体。结果:DNA测序和酶切分析均证明,构建的双启动子表达质粒pCN-SSIE开放读码框架正确;质粒在原核和真核细胞中均能正常表达;在免疫小鼠的血清中检测到了高水平的抗SBR特异IgG。结论:构建成功双启动子表达质粒pCN-SSIE,在体外真核和原核细胞中均能正常表达,用其作为DNA疫苗免疫动物,可诱导明显的免疫应答。

防龋基因疫苗pcDNA3-PAc兔鼻腔黏膜免疫防龋的实验研究

目的：观察防龋基因疫苗pcDNA3-PAc经鼻腔黏膜免疫日本长耳大白兔后的免疫反应性，确定不同剂量质粒pcDNA3-PAc免疫机体后的抗体效价。方法：30只日本长耳大白兔随机分为5组，每组6只，分别为200、400、600μg pcDNA3-PAc质粒组；400μgpcDNA3质粒组（阴性对照组）；灭活全菌疫苗组（阳性对照组）。质粒组及全菌组以1：1比例添加弗氏佐剂后进行免疫，共免疫2次。采用间接ELISA法检测血液、唾液中特异性IgG、S—IgA抗体。采用SPSS17．0软件包对数据进行统计学分析。结果：①血液、唾液中抗体高峰时间为初始免疫后8～10周左右；②自免疫后第3周开始，200、400、600μg组兔血清、唾液中特异性抗PAc的IgG、S-IgA抗体水平与阴性对照组相比，差异有显著性（P〈0．05）；③200μg组与400μg及600μg组相比，多时间点差异有显著性（P〈0．05）。结论：①防龋基因疫苗pcDNA3-PAc具有免疫反应性，可诱导免疫反应长达14周；②200、400、600μg的防龋基因疫苗pcDNA3-PAc对体重1．5kg左右的兔都是有效的免疫剂量；③在本研究条件下，400、600μg疫苗组效价优于200μg组。

DNA防龋疫苗不同途径免疫BALB/c小鼠的实验研究

目的 :观察编码pac结构基因A -P片段的重组质粒pCIA -P以不同途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应。方法 :重组质粒pCIA -P经鼻腔滴注和颌下腺区皮下腺注射两种途径免疫小鼠 ,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。结果 :滴鼻法和皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高 ,并持续数周。且滴鼻法比皮下注射法诱导唾液IgA型特异性抗体要早。结论 :重组质粒pCIA -P是一种有效的免疫原 ,滴鼻法和颌下区皮下注射法接种防龋DNA疫苗都可有效诱导机体全身及局部黏膜免疫应答。而滴鼻法较皮下注射法能更早诱导局部黏膜免疫应答。

基因重组乳链球菌防龋疫苗主动免疫防龋研究 Ⅱ 皮下注射免疫孕兔的实验研究

目的：了解基因重组乳链球菌防龋疫苗皮下注射免疫孕兔的抗龋效果。方法：通过酶联免疫吸附检测法分析孕兔免疫前后血清、唾液和乳清中抗变形链球菌表面蛋白抗原的抗体水平。结果：腮腺和乳腺周围区域皮下注射免疫１周～２周后血清ＩｇＧ型特异性抗体、唾液和乳清ＩｇＡ型特异性抗体均有明显升高。结论：基因重组乳链球菌ＨＬ１０７具有变形链球菌表面蛋白抗原的免疫原性。

1.0%与0.2%葡萄糖环境中口腔变形链球菌基因表达的差异

目的观察1.0%与0.2%葡萄糖营养条件对变形链球菌基因表达的影响。方法变形链球菌分别在1.0%和0.2%葡萄糖条件下培养,利用前期构建的变形链球菌基因表达谱检测芯片筛选两种培养条件下变形链球菌中差异表达的基因,以观察环境葡萄糖供给情况对变形链球菌基因表达的影响。结果相对于0.2%葡萄糖,在1.0%葡萄糖条件下变形链球菌中有57种基因表达发生显著变化,其中与变形链球菌糖转运系统和能量代谢、黏附等细菌毒力、DNA复制、重组、修复、信号传递与调控系统、细菌表面成分等相关的41种基因表达明显上调,而一些参与细胞生理过程的感受态蛋白和酶的16种基因表达显著下调。结论不同葡萄糖供给情况影响变形链球菌多种基因的表达。

可生物降解聚合物载体微球口服防龋疫苗免疫效果

【目的】以PAc多肽(301～319)作为抗原,PBLG-PEG-PBLG做载体制备防龋微球疫苗,口服免疫SD大鼠,观察其对变链菌在大鼠牙面的黏附及对龋病发生的影响效果。【方法】28只出生30d的雄性SD大鼠随机分成4组建立龋模型,对各组大鼠口腔中变链菌的黏附菌落计数,根据Keyes评分标准做龋齿记分。【结果】PAc多肽抗原微球疫苗口服组的变形链球菌数为(13.2±8.16)×104CFU/ml;磨牙龋齿Keyes计分为31.8±6.77,均显著低于对照组(P<0.01)。【结论】口服PAc多肽抗原微球防龋疫苗均能减少龋模型大鼠龋齿的发生,以光滑面龋的减少更显著。

表达嵌合体蛋白PAcP/CTB的转基因番茄防龋疫苗口服免疫大白兔的研究

目的观察表达嵌合体蛋白PAcP/CTB转基因番茄防龋疫苗的免疫原性和免疫反应性。方法用PAc标准蛋白制作标准曲线,ELISA法检测番茄果实PAcP/CTB蛋白的浓度。实验动物按完全随机分组法分为3组,实验组喂食3个剂量(PAcP/CTB蛋白量相差1.5倍)的转基因番茄汁,阴性对照组喂食非转基因番茄汁,阳性对照组喂食变异链球菌灭活全菌疫苗。每周免疫1次,免疫4周,ELISA法检测大白兔唾液和血液样品中抗变异链球菌PAc的IgA、IgG抗体效价水平。结果转基因番茄中PAcP/CTB嵌合蛋白的浓度为9.37μg/mL。疫苗免疫动物后实验组与阳性对照组大白兔唾液和血液中的特异性抗PAc抗体升高,抗体水平可维持数周,而阴性对照组抗体水平变化不明显。结论表达嵌合体蛋白PAcP/CTB的转基因番茄免疫新西兰大白兔后,能有效的诱导唾液和血液中特异性抗体的产生,其具有较好的免疫原性。

减毒鼠伤寒沙门菌防龋疫苗的免疫防龋效果

【目的】采用减毒鼠伤寒沙门菌S .typhimuriumSL32 6 1(pET 17b/A)防龋疫苗经不同途径免疫定菌大鼠 ,观察其对变形链球菌在大鼠牙面黏附、龋病发生的影响等免疫防龋效果。【方法】将 5 0只大鼠随机分组 ,经口服、皮下、黏膜下途径免疫 ,接种变形链球菌并给予致龋饲料。对各组大鼠口腔中变形链球菌的定居菌落进行计数、黏附率计算 ,收集大鼠颌骨标本 ,根据Keyes评分标准作龋齿计分统计。【结果】口服活菌苗 S typhimuriumSL32 6 1(pET 17b/A)组变形链球菌数为(3 4± 1 4)× 10 4 CFU ;磨牙龋齿Keyes计分总和为 30 7± 6 0 ,均明显低于其它组 (P <0 0 5 )。【结论】口服S typhimuriumSL32 6 1(pET 17b/A)活菌苗可抑制变形链球菌黏附于牙面 ,并能减少龋病发生 ,具有较好的防龋效果。

变形链球菌DNA酶切片段在大肠杆菌中克隆的研究

将变链菌染色体DNA和pBR322 DNA,分别用HindⅢ酶切,再用T_4DNA连接酶连接,转化到大肠杆菌R_5受体菌中。根据插入灭活的原理,筛选Ap^r、Tc^s菌株,并经抗药性、琼脂糖凝胶电泳,酶切、核酸杂交及再转化等试验证明,已将变链菌DNA酶切片段克隆到大肠杆菌中,获得2627个克隆株,建立了基因库。为筛选变链菌保护性抗原基因,进一步研制基因工程龋齿菌苗奠定了基础。

葡糖基转移酶多肽偶联疫苗抗原性

目的 :研究人工合成葡糖基转移酶GTF第 5 5 2～ 5 70位的多肽疫苗HDS的免疫原性。方法 :将HDS与大分子载体钥孔帽贝血蓝蛋白偶联后 ,在腮腺区皮下免疫大鼠 ,取鼠血清 ,Westernblot法检测鼠血清抗GTF抗体。结果 :硝酸纤维膜上 4 3KD 6 6KD间出现强阳性条带 ,此条带位置与葡糖基转移酶经SDS PAGE电泳后条带位置一致。结论 :抗人工抗原HDS KLH抗体能与葡糖基转移酶发生抗原抗体反应 ,抗HDS

DNA防龋疫苗经TSG途径免疫BALB/c小鼠实验研究

目的观察编码PAc结构基因A-P片段的重组质粒pCIA-P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射(TSG)两种途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应,并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法将25只BALB/c小鼠随机分为4组,分别以重组质粒pCIA-P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA-P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc。结果颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高,并持续数周。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高,但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论重组质粒pCIA-P是一种有效的免疫原,该DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期粘膜免疫的有效途径。

老年人牙菌斑中变形链球菌临床分离株的基因型分析

目的:探讨老年高龋和无龋人群牙菌斑中变形链球菌临床分离株基因型与龋病的关系。方法:将79例老年人分为高龋组(55例)和无龋组(24例),从两组个体口腔牙菌斑中分离鉴定出263株和102株变形链球菌(血清型c),用细菌DNA提取盒提取细菌染色体DNA,经多次实验自行确定AP-PCR反应条件,对获得的变形链球菌(血清型c)临床分离株进行遗传型分析。结果:两组同一个体临床分离株共发现了101种不同基因型。高龋组同一个体口腔中定植不同基因型菌株的数量与无龋组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:不同个体分离出的变形链球菌菌株间具有明显的遗传多态性;个体携带不同基因型菌株的数量与其致龋性有密切关系。

变形链球菌基因疫苗pc DNA3-gtfB鼻黏膜免疫家兔的实验研究

目的观察变形链球菌防龋基因疫苗pcDNA3-gtfB经鼻腔黏膜免疫日本长耳大白兔后的免疫反应性，初步观察不同剂量质粒pcDNA3-gtfB免疫机体后的抗体效价。方法实验分两部分，第一部分：30只日本长耳大白兔平均分为5组，每组6只，分别为：200μg、400μg、600μgpcDNA3-gtfB佃质粒组，400μg pcDNA3组，灭活全菌疫苗阳性对照组。质粒组及全菌组以1：1比例添加弗氏佐剂后进行免疫，共免疫两次。第二部分：采用间接ELISA法检测血液、唾液中特异性IgG、S-IgA。结果①血液、唾液中抗体高峰时间为初始免疫后8～10周左右；②自免疫后1～2周，各质粒组兔血液、唾液中特异性抗GTF的IgG、S-IgA抗体水平同阴性对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）；③200μg组与400μg及600μg组比较多时点差异有统计学意义（P〈0．05）。结论①基因疫苗pcDNA3-gtfB具有免疫反应性；②200μg、400μg、600μg的基因疫苗对于体重1．5kg左右的兔都是有效的免疫剂量；③在本研究的条件下，400μg、600μg疫苗组效价优于200μg组。

重组GBR蛋白免疫动物的实验研究

目的:构建变形链球菌葡糖基转移酶葡聚糖结合区段(GBR)基因的表达载体,探讨重组GBR蛋白的免疫原性。方法:通过PCR、T-A克隆等技术,构建GBR基因表达载体pTriEx-4-GBR,对所构建的表达载体进行DNA序列测定和酶切图谱分析;IPTG诱导pTriEx-4-GBR中目的基因在大肠杆菌JM109(DE3)表达,纯化、浓缩重组GBR蛋白;Balb/c小鼠随机分为2组:实验组用重组GBR蛋白经皮下注射免疫,对照组用生理盐水代替重组GBR蛋白;ELISA法检测小鼠血清抗GBR特异性抗体;用统计软件PEMS3.0对数据进行处理。结果:载有GBR目的基因的表达质粒pTriEx-4-GBR序列及读码框架正确;诱导表达获得的重组GBR蛋白浓度和纯度均较高;用该重组蛋白对小鼠作皮下接种免疫后,诱导产生血清抗GBR特异IgG显著应答(P<0.005)。结论:表达载体pTriEx-4-GBR构建成功,所获得的重组GBR蛋白能诱导小鼠特异免疫应答,为进行进一步相关实验研究奠定了基础。