龙牙百合的植株再生与遗传转化

以龙牙百合鳞片叶切块为外植体 ,通过多种培养基的比较试验 ,得出MS +2 ,4 -D 2mg/L +6 -BA0 2mg/L是诱导愈伤的最佳培养基 ,MS +6 -BA 1mg/L +NAA 0 0 5mg/L是不定芽诱导及伸长的适宜培养基。MS +NAA 2mg/L是生根的最佳培养基。本试验已建立了适用于龙牙百合遗传转化的快速高频再生系统。用携带有几丁质酶基因和 β - 1、 3葡聚糖酶基因的工程菌 ,通过农杆菌介导法和基因枪转化法转化龙牙百合 ,经PCR和点杂交检测证明外源基因已经整合到植物染色体中。同时对农杆菌介导法和基因枪法进行比较 ,发现农杆菌介导法的转化率为 16 7% ,基因枪法的转化率为 5 0 % ,因此可能基因枪转化法更适于龙牙百合的遗传转化。

棉花基因枪茎尖转化研究

对棉花茎尖轰击转化的多种因素进行了分析,建立了较为完善的基因枪茎尖转化体系,使抗性转化率达到4.7％～9.4％,转化周期缩短至2～3个月,改进了抗性筛选程序,建立了4次筛选法,获得91株抗生素抗性植株;同时对部分植株目的基因的表达量进行了初步的遗传分析。结果表明,茎尖的轰击状态与抗性筛选程序对转化周期与转化率具有决定性作用。

基因枪介导的西瓜遗传转化研究

为了建立基因枪介导的西瓜遗传转化系统 ,以西瓜顶芽为受体 ,p BI12 1为供体 ,采用正交试验设计 ,研究了基因枪的扩散腔类型、轰击次数、受体的预培养和高渗处理对转化率的影响 .经方差分析与差异显著性测验 ,预培养时间与轰击次数对转化率影响显著 ,而扩散腔类型和甘露醇处理质量浓度对转化率的影响不显著 .经组织化学检测 ,有 33.3%抗 Kan试管苗为

抗虫、抗除草剂转基因玉米的获得及遗传研究

利用PIG基因枪 ,将cryIA(b)基因和bar基因 ,采用共转化法导入玉米自交系的幼胚中 ,经PPT筛选 ,获得抗性愈伤组织并再生植株。除草剂抗性检测、点杂交和Southern杂交分析表明 ,在多数转基因植株中cryIA(b)基因和bar基因共整合 ,且呈孟德尔单位点显性基因连锁遗传。Northern杂交及ELISA检测表明 ,cryIA(b)基因在转录和翻译水平进行了有效的表达。

用绿色荧光蛋白进行转基因蚕研究

绿色荧光蛋白（ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）基因用基因枪和压力渗透法导入蚕卵，它的表达由家蚕核多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）的即刻早期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙｅａｒｌｙｓｔａｇｅ，ＩＥ）蛋白基因启动子控制。在紫外灯下能观察到少数５龄幼虫身上显示绿色荧光斑点，ＰＣＲ实验证实部分蚕染色体ＤＮＡ中含有ＧＦＰ基因。

基因枪转化玉米愈伤组织参数的优化

以玉米愈伤组织为受体 ,借助GUS基因的短暂表达 ,优化了PDS 10 0 0 /He型基因枪和自制基因枪的基因枪转化参数。PDS 10 0 0 /He型基因枪转化玉米愈伤组织的最佳轰击参数为 135 0psi压力 ,2 5In·Hg真空度 ,6cm射击距离。自制基因枪转化玉米愈伤组织的最佳轰击参数为0 6MPa 。

基因枪轰击不同剂量小鹅瘟病毒VP3基因疫苗在雏鹅体内的动态分布

本文开展了检测小鹅瘟病毒(GPV)VP3基因的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法的建立和基因枪轰击不同剂量(1、3和6μg)GPV-VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)在30日龄四川白鹅体内(心、肝、脾、肺、肾、法氏囊、胸腺、哈氏腺、十二指肠、空肠、回肠、直肠、盲肠、胰腺、血液、脑及注射部位皮肤)分布规律的研究。结果表明:①建立的FQ-PCR特异性强、灵敏度高、重复性好,核酸模板数与FQ-PCR测定的Ct值相关系数达到0.999,具有很好的直线相关性;②pcDNA-GPV-VP3各剂量免疫雏鹅1 h即可在各组织中检测到,其中注射部位含量最高,肝、肾、淋巴器官(脾、法氏囊、胸腺、哈氏腺)含量较高;③到免疫后217 d时,1μg组免疫雏鹅各个组织器官内仍检测到pcDNA-GPV-VP3的存在,但多数组织器官中的含量比1 h时约少了4个数量级,其中免疫部位减少了7个数量级;④血液中pcDNA-GPV-VP3的含量较少,且免疫后1 h^217 d各时间点的差异不显著(P≥0.05);⑤不同剂量pcDNA-GPV-VP3免疫雏鹅各组织中的含量呈现的总体规律为6μg组>3μg组>1μg组,但差异不显著(P≥0.05)。因此,FQ-PCR是定量检测pcDNA-GPV-VP3在免疫雏鹅体内含量的可靠方法,pcDNA-GPV-VP3免疫雏鹅后1 h时可分布至雏鹅体内各组织器官中并持续存在217 d以上。

基因枪注射BALB/c小鼠制备Graves病模型

目的：探讨基因枪注射和普通质粒肌肉注射两种不同方法对甲亢动物模型的差异。方法：将45只小鼠随机分成4组，分别用基因枪金颗粒包裹质粒免疫、普通质粒肌肉注射免疫。加强免疫后第4周后处死小鼠，RIA法测定血清FL、FT4、TSH水平。RIA法测定血清与hTSHR-CHO孵育后上清cAMP浓度以计算TRAb活性，RIA法测定脾脏培养后IL-4的浓度，ELISA法测定血清TSAb浓度，取甲状腺做石蜡HE切片观察组织学变化。结果：基因枪免疫组（GGI）动物4周后血清FT4（0．34±0．11）pg／ml高于质粒肌肉注射组（PLS）（0．21±0．06）pg／ml和基因枪免疫空质粒组（GG0）（0．17±0．08）pg/ml（F=14．34，P=0．002）。GGI组TRAb活性（167．27±117．37）％高于PLS组（113．81±65．50）％和GG0组（98．27±14．80）％（Hc=35．198，P=0．007）。GGI组脾脏培养上清液IL-4产量（0．244±0．092）pmol／L明显高于PLS组（0．173±0．039）pmol／L和GG0组（0．151±0．041）pmol／L（F=7．0403，P=0．005）。GGI组TRAb浓度（29．3±1．2）U／L明显高于GG0组（13．3±0．2）U／L（F=9．02，P〈0．001），但和PLS组（24．3±0．9）U／L比无显著性差异（q=-1．32，P=0．423）。HE切片观察造模成功小鼠甲状腺滤泡细胞高柱状排列，未出现甲状腺细胞破坏甲状腺炎的嗜酸性变。结论：基因枪免疫雌性BALB／c鼠是一种可行的复制Gmves动物模型，在免疫第2～4周可以观察到FT4升高和自身抗体改变等理想的免疫效果。

基因枪法获得转cry1Ac基因甘蔗的研究

根据定向克隆原则,以pGreenⅡ0229为载体骨架,cry1Ac为目的基因,bar为筛选标记基因,构建了大小为8602bp的植物表达载体pUBCG0229-cry1Ac。酶切结果表明,构建的载体pUBCG0229-cry1Ac结构完全正确。用基因枪轰击法将pUBCG0229-cry1Ac质粒DNA转化甘蔗(Saccharum Complex)品种福农95-1702和桂糖94-119的胚性愈伤组织,使用PPT(phosphinothricin)对轰击后的材料进行继代、分化和生根筛选,移栽成活后使用Basta溶液喷洒进行初步筛选,共获得86株抗性植株,通过PCR检测、Dot-Southern检测及PCR产物测序,证明已将cry1Ac基因整合到其中22株甘蔗基因组中。

叶绿体遗传转化:植物导入外源基因的新途径

叶绿体转化系统 ,独立于传统的核转化 ,为植物导入外源基因提供了新途径。它有如下优点 :超量表达目的基因 ;以定点整合方式导入外源基因从而消除了位置效应及基因沉默 ;具原核表达方式 ,能以多顺反子的形式表达多个基因 ;母系遗传方式可防止基因扩散 ;基因产物区域化并能提供适于某些产物发挥功能的小环境等。随着这项技术在越来越多的领域发挥作用 ,其优越性逐渐得到认同。本文着重对此技术的特点、发展及应用作一综述。

利用Bt基因和Xa21基因转化获得抗螟虫、白叶枯病的转基因水稻

利用水稻的愈伤组织作受体 ,采用 PIG基因枪法 ,首先成功地将 Bt基因 [cry IA(b) ]连同抗除草剂 bar基因导入栽培水稻品种中国 91,选育出纯合稳定的株系 T91系。然后将 T91系与黄淮区主栽品种豫粳 6号杂交 ,并辅以标记基因选择 ,选育出纯合稳定、综合性状优良的转 Bt基因株系 C48。利用农杆菌介导的转化系统将 X a2 1基因转入 C48,根据标记基因测定 ,转基因植株的 PCR和 Southern分析 ,田间抗病虫性鉴定 ,获得了双抗 (螟虫、白叶枯病 )

鹅细小病毒VP3基因疫苗两种不同免疫方式对细胞免疫的影响

将构建的鹅细小病毒（GPV）VP3基因疫苗（pcDNA-GPV-VP3）转染鹅胚成纤维细胞（GEF），每隔12h检测VP3蛋白的表达情况，同时以不同剂量分别通过基因枪轰击和肌肉注射免疫28日龄健康雏鹅，于免疫后第3、7、14、21、28、35、49、63、77和105d采血，进行淋巴细胞增殖试验（MTT法）。结果，转染后第24h即可在GEF中检测到GPVVP3蛋白，第60h表达量达到高峰。试验组鹅外周血T淋巴细胞D490nm值在免疫后第35d达到最大。肌肉注射组和基因枪组免疫后第14～63d、第7～63d的D490nm值分别与PBS对照组差异板显著；肌肉注射组及基因枪组免疫后第21～49d的D490nm值显著高于弱毒疫苗对照组；肌肉注射组及基因枪组免疫后第14～63d的D490nm值板显著高于空质粒对照组。表明，基因枪轰击和肌肉注射pcDNA—GPV—VP3均能诱导雏鹅产生良好的细胞免疫应答。

玉米优良自交系转基因受体系统建立及转化后的筛选与再生

通过对培养基和培养条件的筛选和改进 ,提高了诱导玉米优良自交系幼胚产生胚性愈伤组织 ,建立转基因受体系统的效率。通过比较试验 ,确定了潮霉素筛选的浓度和方法。PCR检测证明 ,目的基因已整合到玉米基因组中。

外源钾通道基因在水稻中的表达及其钾吸收特征研究

通过基因枪导入法 ,将外源钾通道基因导入水稻中花 8号、中花 9号、中花 13以及 870 6中表达 ,获得了转基因植株。经 PCR和 Southern检测 ,共获得 4 2个表达了钾通道基因的转基因株系。通过二代的筛选并获得了部分株系的纯合系。转基因植株对钾的吸收累积试验表明 ,与对照相比 ,供试转基因株系的吸钾速率和对钾的累积能力都有明显提高。研究表明钾离子通道在植物体内的表达也能改良植物的钾素营养性状。同时也表明植物营养遗传工程与植物的抗病。

非病毒基因递送技术研究进展

基因递送是生物学和医学研究中一项重要且常用的技术,分为病毒感染法和非病毒转染法两大类。病毒载体具有较高转染效率,但产生不良反应等缺陷限制了其应用。非病毒载体具有低细胞毒性、低免疫原性、生物相容性好、可以生物降解等优点,而且不受基因大小的限制,具有很好的应用前景,但转染效率不高是其主要的瓶颈,目前研究人员正致力于寻找和开发高效率的非病毒转染方法。文中阐述了几种主要的生化转染法(阳离子多聚物、阳离子脂质体、磷酸钙)及物理转染法(电穿孔、超声/微气泡、显微注射和基因枪)的原理、优缺点以及研究进展。

植物瞬时表达技术的主要方法与应用进展

瞬时表达技术是一种获得目的基因短暂的高水平表达的技术。与稳定表达相比,瞬时表达所需时间短,但因未将外源基因整合到宿主植物染色体中,不能稳定遗传给下一代。我们简要综述了植物瞬时表达技术的各种方法,介绍了各方法的原理、技术流程、影响因素及其应用。关于其应用,主要分析了生物制剂的合成、转录元件和转录因子的克隆与分析、基因沉默、亚细胞定位、蛋白互作分析、抑制子功能鉴定、选择性剪接调控、植物品种的改良和选育等方面。

基因枪介导人精子顶体膜相关蛋白32基因疫苗在小鼠骨骼肌中的表达

目的:观察pcDNA3.1(+)-人精子顶体膜相关蛋白32(hSAMP32)基因疫苗经基因枪介导肌肉接种后在小鼠体内的表达。方法:BALB/c雌性小鼠6只,实验组鼠(4只)经后腿股内侧肌以基因枪多点注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hSAMP325μg,空载体对照组(1只)注射pcDNA3.1(+)载体5μg,空白对照组(1只)注射无菌生理盐水200μl。接种后第7d取小鼠股内侧肌注射部位肌肉,RT-PCR和原位杂交法检测目的基因mRNA的表达,以自制抗血清进行免疫组织化学染色检测目的基因蛋白的表达。取小鼠心、肝、脾、脑、肾、胚胎组织,PCR扩增,行基因疫苗的安全性检测。结果:RT-PCR和原位杂交检测结果显示实验组小鼠注射部位肌肉组织有目的基因及其蛋白的表达,对照组未见表达。实验组小鼠心、肝、脾、脑、肾、胚胎的基因组DNA均未扩增出目的基因条带,说明外源性基因没有整合到宿主染色体。结论:该基因疫苗可在小鼠骨骼肌内有效、安全地表达。

基因枪法介导的南瓜的遗传转化体系构建

用南瓜的愈伤组织作受体进行了基因枪的轰击试验,确立了以轰击压力为1 100 psi,轰击距离为9 cm,3μLDNA／mg金粉的轰击比例,优化了基因枪的轰击参数;在轰击前4 h和轰击后16 h用附加有0．4 mol／L甘露醇的MS培养基进行高渗处理、轰击后恢复培养6 d,可以增加转化成功的机率。用1 mg／LBasta作 为选择压,筛选培养45 d后进行GUS基因组织化学染色,结果表明GUS基因可在南瓜的组织中瞬时表达。

微藻高效基因枪转化方法的建立

基因枪法是外源基因导入微藻细胞的重要手段。然而,发展至今,微藻细胞基因枪转化效率一直偏低(10~50个转化子/μg DNA),高价低效的转化方法阻碍了基于高通量转化子的基因功能分析。为了提高基因枪的转化效率,本研究以三角褐指藻为材料,从抗生素选择培养基的改良,微载体的选择、制备、包埋、点膜和轰击参数的优化,以及受体细胞的处理等方面进行了系统研究。结果显示,采用50%海水盐度f/2培养基可以提高博来霉素的效价,f/2固体培养基中2216E营养物质的加入能缩短1/3的平板筛选时间。微载体制备应选择对金(钨)粉没有吸附作用的离心管,制备量/管应少于3.5 mg。微载体轰击量每次大约为0.75 mg,过量将会造成一个轰击死亡圈,过少将导致轰击成本上升。当轰击间距A为6.35 mm,间距B为11 mm,间距C为6 cm时,可以获得最多的转化细胞。109个受体细胞铺成较厚的多细胞层能显著提高转化效率。经过上述优化与改进,本研究将现有文献报道的转化效率提高了4.7~30倍,达到295±60个转化子/μg DNA。该方法除适用于三角褐指藻外,也可广泛应用于其他微藻(杜氏盐藻、小球藻)的基因枪转化研究,可以为微藻基因工程研究提供快速,高效和可靠的操作技术。

基因枪介导重组hGM-CSF转移系统的建立及其在人肿瘤细胞中的稳定表达

目的 :建立基因枪介导的基因转移系统 ,为基因修饰的肿瘤细胞疫苗研究奠定实验基础。方法 :采用基因枪转导的方法 ,将真核表达质粒 (pcDNA3 .1GM CSF)转导入人胃癌细胞株 (SGC) ,经G418筛选获得阳性克隆 (SGC GM CSF) ,通过RT PCR方法鉴定 ,重组载体已整合到胃癌细胞的基因组中。结果 :SDS PAGE和Westernblot分析的SGC GM CSF上清液结果显示rhGM CSF主带在 3 0kD左右 ,SGC GM CSF在体外长期培养中保持稳定分泌 ,分泌量达到 2 4h平均 2 47ng 10 6 cell。结论 :建立的基因枪介导的基因转移系统安全、有效 。