过量表达葡萄糖脱氢酶对E.coli羟基脂肪酸合成能力的影响

在工程大肠杆菌生产羟基脂肪酸的基础上,为解决构建的以葡萄糖为底物合成羟基脂肪酸(HFAs)代谢途径中存在的细胞内还原力(NADPH)不平衡的问题,克隆了来源于巨大芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶(GDH)基因,构建了胞内HFAs和NADPH联产的工程菌株;实验结果表明该重组大肠杆菌合成HFAs的产量得到显著提高,摇瓶条件下HFAs产量达到173.9 mg/L。具有较好的工业化开发前景。

E.coli和B.subtilis溶解性代谢产物对环境因子的响应

为了一步明晰环境因子对微生物溶解性产物形成的影响,选取活性污泥中典型革兰氏阴性菌（E.coli）和革兰氏阳性菌（B.subtilis）作为研究对象,以蛋白质、腐殖酸和多糖表征微生物代谢产物（Soluble Microbial Products,SMP）,研究了培养时间、温度、盐度和阿莫西林对两株菌SMP形成特性的影响。结果表明：当培养时间为0-48h时,E.coli和B.subtilis溶解性代谢产物质量浓度在4 h时达到了最大,分别约为48 h的3.91倍和3.27倍。当温度下降时,E.coli溶解性代谢产物中的多糖和腐殖酸分别在25℃和15℃出现了累积,而B.subtilis产生的SMP仅在15℃出现了腐殖酸累积。当盐度为5-30 mg/L时,E.coli和B.subtilis产生的SMP质量浓度均先增加后减小,分别于盐度为5 g/L和10 g/L时达到最大,组分以腐殖酸为主。当阿莫西林质量浓度为0-3.0 mg/L时,E.coli和B.subtilis产生的SMP质量浓度均先增加后减小,分别于阿莫西林质量浓度为1.0mg/L和1.5 mg/L达到最大,组分以腐殖酸和多糖为主;然而当阿莫西林质量浓度为3.0 mg/L时,两菌株产生的SMP组分以多糖为主。可见,过短的停留时间、低温、高盐和较高质量浓度的阿莫西林都会诱导E.coli和B.subtilis产生更多的SMP,但它们之间存在一定的差异。

重组人血管内皮抑制素(rh-Endostatin)大肠杆菌表达体系发酵条件的优化

优化了重组人血管内皮抑制素的E.coli表达体系的发酵条件。利用E.coli表达体系得到了较高的产量,在9h左右的发酵周期内达到OD600值140,包涵体蛋白产量为3g/L。主要优化了异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)的终浓度、诱导时间、培养温度、补料控制方法等条件,并且在诱导后提高培养温度到40℃,在非常短的培养周期内达到了高密度培养的目的。利用E.coli表达,继而通过复性获得有活性的重组人血管内皮抑制素,成本低、生产过程稳定可控、得到的蛋白性质稳定,符合工业生产的需要。

大肠杆菌高效表达重组蛋白策略

大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早和目前应用最广的经典表达系统。利用该系统表达重组蛋白具有许多优越性,但其表达效率受诸多因素的影响。综述了国内外利用大肠杆菌表达系统高效表达外源蛋白的策略,主要包括选择合适的启动子、改变信号肽结构、提高 mRNA稳定性、提高翻译效率、表达稀有密码子、降低包涵体形成及蛋白降解,利用融合蛋白与分子伴侣、调控发酵条件实现高密度培养等。

重组人白细胞介素15工程菌高密度发酵条件探讨

目的研究表达重组人白细胞介素15(rhIL-15)工程菌高密度发酵的条件。方法采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长和目的蛋白质表达的因素进行优化。结果以甘油为碳源可明显抑制有害物质乙酸的积累,提高工程菌的表达量和收获率。高密度发酵明显提高了目的蛋白质的表达量和工程菌的产量。结论该发酵工艺大大提高了rhIL-15工程菌的产量和表达水平,为rhIL-15的规模化生产打下了基础。

高光学纯度L-乳酸工程菌的构建及其蔗糖发酵

本研究以可利用蔗糖发酵产D-乳酸的工程菌WD 206为出发菌株(ΔcscR,ΔadhE,ΔfrdBC,Δpta,ΔpflB,Δal-dA),敲除D-乳酸脱氢酶基因(ldhA),并插入乳酸片球菌pediococcus.acidilactici的L-乳酸脱氢酶基因(ldhL),以构建L-乳酸工程菌WL306。该菌在60h的发酵过程中,可将100g/L的蔗糖转化生成81.92g/L的乳酸,产率为82%,在发酵产物中占99.5%;L-乳酸的光学纯度高达99.9%。该结果说明此工程菌具有生产高纯度L-乳酸的工业开发潜力,为采用廉价碳源材料(甘蔗渣,糖蜜)生产打下良好基础。

茶氨酸生物合成基因工程菌的质粒稳定性研究

研究了茶氨酸生物合成基因工程菌重组质粒pET32a-GGT的稳定性。结果表明,该基因工程菌在连续传代100代后,质粒的目的基因片断没有缺失,具有结构稳定性;但在无抗生素选择压力下,连续传代20代后开始出现质粒丢失的细胞,连续传代100代后18%的细胞含有正常质粒,因此,表现出一定的分裂不稳定性。该基因工程菌在优化培养基和优化条件下的整个发酵过程中,始终表现出良好的结构和分裂稳定性,γ-谷氨酰转肽酶的活性为4.64U/ml,催化合成茶氨酸的产量为35.18g/L。

大肠杆菌中乙醇合成途径的构建

采用PCR技术扩增了运动发酵单孢菌Zymomonasmobilis的两个产乙醇的关键酶基因pdc和adhⅡ ,分别克隆到载体 pUC19和pUC18中 ,形成重组质粒 pUC19::pdc和 pUC18::adh ,从中分离出两基因并串联到经EcoRⅠ酶切的 pUC18中 ,转化大肠杆菌E .coliDH5α获得重组质粒 pPA .携带pPA的重组菌Pp +a被证明具有丙酮酸脱羧酶酶活且提高了乙醇脱氢酶酶活 .

重组人骨形态发生蛋白-2在大肠杆菌中的表达及纯化

目的用基因工程技术在大肠杆菌中表达人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)。方法hBMP－2原核表达载体pYR(pBV220－hBMP-2)转化 E coli BL21,SDS－PAGE分析工程菌活化状态以及诱导时间与目的蛋白表达率的关系。离子交换层析 DEAE和分子筛 S－300纯化重组蛋白,自然缓降复性法对其复性。结果SDS－PAGE显示在相对分子质量约为13000时出现明显外源蛋白表达带,而且当工程菌30℃活化至D600约为0．45时,其表达效率较高;在此状态下,温度诱导衣达4h,目的蛋白表达量最高,以后随着时间的延长,表达量稍下降。重组蛋白经纯化后植人小鼠肌肉,组织学观察到肌肉内大量间允质细胞增生以及软骨与骨形成。结论重组hBMP－2具有良好异位成骨活性。

高产琥珀酸重组大肠杆菌的构建及厌氧发酵

以野生型大肠杆菌Escherichia coli W为出发菌株,利用Red同源重组系统分别敲除了乳酸脱氢酶基因(ldhA)、乙醇脱氢酶基因(adhE)、丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)、丙酮酸氧化酶基因(poxB)和乙酸激酶基因(ackA),再通过无氧生长进化筛选过程,构建得到在厌氧条件下能有效生长,并以琥珀酸为主要发酵产物的重组大肠杆菌WS100(△ldhA,△adhE,△pflB,△poxB,△ackA)。利用15 L发酵罐进行厌氧发酵测定显示,经72 h发酵,菌体密度OD600最大值可提高至6.48,琥珀酸产量达到70.13 g/L,琥珀酸的生产强度为0.98 g/(L.h),葡萄糖-琥珀酸转化率为76%。发酵液中副产物含量低,乙酸含量为5.34 g/L,乳酸产量仅为0.15 g/L,未检测到甲酸和乙醇生成。结果表明,厌氧条件下,该工程菌可有效利用低营养成分的无机盐培养基,在不表达任何外源基因的条件下可稳定高产琥珀酸,具有极大的工业化开发前景。

油料作物维生素E含量的研究进展

介绍了维生素E的类型、来源及理化性质;概述了生育酚在油料作物中的含量、组成及遗传变异研究进展和生育酚相关基因的研究动态;展望了提高油料作物维生素E含量的发展前景。

重组大肠杆菌生产极端耐热木聚糖酶

将含有来自于嗜热网球菌(Dictyoglomusthermophilum)Rt46B.1编码极端耐热木聚糖酶基因xynB的表达载体pET?DBc转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3),获得重组菌E.coliDB1,目的基因可表达出有活性且耐90oC的木聚糖酶.初步优化的E.coliDB1发酵培养基的组成为(g/L):葡萄糖50,NH4Cl3,MgSO40.5,CaCl20.6,Na2HPO4?7H2O12.8,KH2PO43.0,NaCl0.5.重组菌E.coliDB1木聚糖酶的耐热特性有利于木聚糖酶的下游回收和提取.

新型聚乙烯醇微囊的制备及其结构性能研究

采用低温物理交联法制备新型聚乙烯醇微囊,所得微囊机械强度好,克服了目前普遍采用的海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊易碎的缺点,在APA微囊已完全破碎的机械强度下,聚乙烯醇微囊的破碎率仅为3%.在体外模拟肠胃生理极限条件下可保持稳定的物理化学性质,对尿素、尿酸和肌酐等小分子具有良好的通透性,能在10min内完全通透.将高效分解尿素的脲酶基因工程菌E.coliDH5包埋于聚乙烯醇微囊之中,其工程菌仍具有很高的分解尿素能力,其活力约为自由菌的80%.

人干细胞因子基因大肠杆菌表达产物结构分析及活性研究

目的 确证人干细胞因子基因在大肠杆菌表达产物的正确性。方法 通过蛋白质杂交 ,氨基酸末端序列分析 ,质谱分析及动物体内生物活性的研究 ,对人干细胞因子基因大肠杆菌表达产物———重组人干细胞因子 (rhSCF)分子进行了鉴定。结果 大肠杆菌表达产物rhSCFN端 15个氨基酸序列及C端 2个氨基酸序列与理论推测一致 ,产物的相对分子质量为 185 83.75 ,质量肽谱与理论序列的重叠率为 98.2 % ,动物试验亦表明当与粒细胞集落刺激因子 (G CSF)联用具有显著的外周血干(祖 )细胞动员作用。结论 人干细胞因子基因大肠杆菌表达产物与理论推测完全一致 ,为其中试及临床试验奠定了基础。

代谢工程改造大肠杆菌生产乳酸的研究进展

乳酸是自然界中最小的手性分子,广泛应用于食品、医药和化工等领域,同时也是合成生物可降解塑料——聚乳酸的前体。目前,化学合成法和微生物发酵法是生产乳酸的两种主要方法,而后者在底物的可再生性、产物光学纯度和环境友好等方面均具有潜在优势。自然界中许多微生物细胞都能合成和积累乳酸,如大肠杆菌、酿酒酵母和乳酸菌等。与乳酸菌、芽胞乳杆菌和谷氨酸棒状杆菌等乳酸生产菌株相比,大肠杆菌具有生长速度快、营养要求简单、易于高密度发酵、代谢网络清楚、遗传操作方法成熟和产物乳酸光学纯度高等优势。本文中,笔者介绍了乳酸的研究现状及其在工业生产领域中的作用,系统综述了国内外通过代谢工程改造大肠杆菌生产乳酸的研究进展,在此基础上展望了乳酸生产研究的发展方向,以期为其工业应用提供参考。

油料作物种子维生素E基因工程研究进展

通过对维生素E代谢深入研究,人们已经基本弄清维生素E的合成途径。在植物不同组织维生素E的含量和组成各异。维生素E具有多种重要功能:是人类和动物维持生殖系统和免疫系统正常功能所必需的微量营养元素;维生素E因其抗氧化性能保护生物膜免受氧化而与预防多种疾病以及抗衰老有关;维生素E还能抑制油脂的自动氧化和酸败,延长食用植物油贮存期。维生素E的活性和抗氧化性与其组成和含量相关。对维生素E的基因工程研究主要从改变总量和各成分比重入手,通过单点和多点调控调节代谢,改变油料作物维生素E的组成。综述了维生素E合成代谢途径以及当今利用基因工程改变维生素E的策略和途径。

用平板计数和聚合酶链反应法检测湖水中大肠杆菌基因工程菌的稳定性

用平板计数和聚合酶链反应（ＰＣＲ）法，检测了暴露于不同温度条件下自然湖水中大肠杆菌基因工程菌（ＭＭ３）的存活与衰亡规律。平板计数结果表明，４℃湖水中ＭＭ３的平均存活率为３５．３５％，２０℃为２２．１８％，３０℃为２０．１８％。ＰＣＲ检测指出，自然湖水温度的高低和暴露ＭＭ３周期的长短对检测结果没有影响。用含有氯霉素的ＬＢ平板，检测不同温度湖水中ＭＭ３的质粒稳定性。

日光辐射对大肠杆菌宿主菌和工程菌存活影响的初步研究

本文观察了不同辐射强度的自然日光照射下，对大肠杆菌宿主菌（Ｋ１２—Ｃ６００）和工程菌（ＭＭ３）在光滑表面（不锈钢）上的存活影响。结果表明，暴露２０ｍｉｎ日光累积总辐射１．１４ＭＪ／ｍ２，宿主菌的存活率为０．０２％，工程菌则为０。散射暴露８０ｍｉｎ，日光累积强度０．９０ＭＪ／ｍ２，宿住菌和工程菌的存活率比值为２：１。黑暗环境下，暴露６天对宿主菌采样仍有细菌存活，工程菌暴露２天的存活率为０。可见，无论是日光总辐射，散射辐射还是黑暗环境，宿主菌的抵抗能力都比工程菌强。在含有４０μｇ／ｍｌ的氟霉素平皿上测定工程菌＊的稳定性，初步测试结果表明，无论是光照还是黑暗环境，该工程菌的质粒都比较稳定。

表达金丝桃素合成酶的基因工程菌发酵工艺研究

采用摇瓶发酵试验,分别对影响工程菌生长和表达的条件:培养基初始pH值、诱导温度、诱导时间、诱导物浓度等进行了考察,优化了重组大肠杆菌的发酵条件,确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺,即工程菌在pH值为7.4、温度为25℃、IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖)浓度为0.8mmol/L时蛋白表达量最高。

耐高温葡萄糖异构酶重组菌发酵与转化条件研究

耐高温的葡萄糖异构酶(glucose isomerase,GI)在高温下可将D-葡萄糖异构化为D-果糖,获得的高果糖浆可作为甜味剂应用于食品诸多领域。对Thermus oshimai GI重组菌发酵产酶条件和全细胞转化D-葡萄糖生成D-果糖工艺进行研究。确定诱导温度28℃,诱导剂终浓度0.1 mmol/L,发酵培养基添加5 mmol/L Mn^(2+)的最优产酶发酵条件;将最优转化体系放大,包括20 g/L湿菌体、10 mmol/L Mn^(2+)和200 g/L底物,于95℃和pH 7.5条件下生物转化4 h,D-果糖得率高达57.34%。该工艺具备一步法生产F55型高果糖浆的可能性,可简化后续浓缩分离等步骤,为进一步使用食品安全的表达系统生产F55型高果糖浆提供理论依据。