以Insig-2基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立

目的通过双荧光素酶报告基因检测系统建立以胰岛素诱导基因2(insulin-induced gene 2,Insig-2)启动子为靶点的药物筛选模型。方法将人Insig-2基因启动子序列克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,构建重组质粒pGL3-Insig-2并与内参质粒pRL-TK瞬时共转染工具细胞,通过检测荧光素酶报告基因表达水平的变化反映Insig-2基因启动子启动转录的活性,并对共转染质粒比例、工具细胞选择等条件进行探索和优化,相关药物处理进行验证。结果成功构建了重组质粒pGL3-Insig-2;确认pGL3-Insig-2:pRL-TK共转染比例为4∶1,确定3T3-L1细胞为工具细胞;1,25-(OH)2D3、小檗碱和姜黄素均能明显增强Insig-2基因启动子活性。结论成功建立了以Insig-2基因启动子为靶点的药物筛选模型,为筛选新型调脂药奠定基础。

纳米基因载体在植物遗传转化中的应用进展

利用纳米材料构建的纳米基因载体在植物遗传转化领域具有特殊的优越性,已成功应用于多种植物的遗传转化。主要阐述了纳米基因载体的特征、分类,综述了无机纳米基因载体、天然高分子纳米基因载体、人工合成高分子纳米基因载体在植物遗传转化中的应用进展,并对纳米基因载体在植物遗传转化领域的应用前景进行了展望。

多巴胺仿生修饰超顺磁性纳米颗粒作为基因载体的可行性研究

评价氧多巴胺仿生修饰超顺磁性纳米颗粒(polymerization dopamine modified superparamagnetic iron oxide nanoparticles,PDA-SPIONs)作为体外基因载体的可行性.方法:利用琼脂糖凝胶电泳对PDA-SPIONs结合DNA能力进行表征,应用绿色荧光蛋白报告基因系统,检测PDA-SPIONs将外源基因转染至HEK293T细胞系的转染可能性.结果:PDA-SPIONs对HEK293T细胞系形态产生明显影响,将外源基因转染至HEK293T细胞系的能力较弱.结论:PDA修饰的磁性纳米颗粒需进一步修饰改造才能用于体外转染的新型非病毒基因载体.

COL4A3基因3'UTR双荧光素酶报告基因载体构建及其与miR-299靶向关系验证

目的探讨双荧光素酶报告基因载体构建并鉴定微小RNA-299(miR-299)与Ⅳ型胶原α3链(COL4A3)基因的靶标关系,为miR-299调控COL4A3基因影响干细胞成软骨分化研究奠定基础.方法2018年3月至2018年12月,利用生物信息学方法预测miR-299与COL4A3-3'UTR区(3'端非翻译区)的潜在结合位点,并通过PCR法扩增COL4A3-3'UTR野生和突变序列,将其克隆至psiCHECK-2质粒中构建相应载体,载体鉴定采用酶切法和基因测序法.细胞复苏、扩增并转染,转染分4组,每组3孔,分别为:①COL4A3-WT加miR-299/NC.②COL4A3-WT加miR-299-inhibitor/NC-inhibitor.③COL4A3-MUT加miR-299/NC.④COL4A3-MUT加miR-299-inhibitor/NC-inhibitor;采用双荧光素酶检测试剂盒测定各组荧光素酶活性并行t检验比较组间差异,P<0.05为差异有统计学意义.结果酶切及DNA测序结果显示psiCHECK-2-COL4A3双荧光素酶报告基因载体构建成功.Luciferase检测显示:野生型COL4A3基因组间比较,miR-299转染组(R/F均值为59.38%)较NC组(R/F均值为100%)荧光素酶活性下降,组间差异有统计学意义(P<0.05);野生型COL4A3基因加inhibitor后组间比较,miR-299-inhibitor组(R/F均值为153.98%)较NC-inhibitor组(R/F均值为100%)荧光素酶活性上升,组间差异有统计学意义(P<0.05);突变型COL4A3基因组及突变型组加入inhibitor后组间比较,miR-299转染组(R/F均值为102.09%)及miR-299-inhibitor组(R/F均值为108.51%)较对应NC组(R/F均值为104.70%)及NC-inhibitor组(R/F均值为105.13%)比较,荧光素酶活性差异均无统计学意义(P>0.05).结论COL4A3基因3'UTR双荧光素酶报告基因载体构建成功,并通过双荧光素酶实验进一步验证了miR-299直接作用于靶基因COL4A3-3'UTR区域的真实性.