孕酮诱导非洲爪蟾卵母细胞生发泡破裂(GVBD)试验方法的优化及干扰物质筛查

非洲爪蟾卵母细胞生发泡破裂(GVBD)是生物学上研究卵细胞成熟过程及其机制的良好模型。由于GVBD受激素的调控,曾有研究将孕酮诱导的非洲爪蟾GVBD试验用于内分泌干扰物的筛查。通过预注射人体绒毛膜促性腺激素(HCG)提高非洲爪蟾卵母细胞对孕酮的敏感性、缩小个体差异,缩短试验时间等优化GVBD试验方法;并选用甲氧氯作为阳性参照物对优化的方法进行验证,最后用此方法研究了米非司酮、来曲唑、咪鲜胺3种化学物质对孕酮诱导GVBD的影响。结果发现,甲氧氯对GVBD的发生具有明显抑制作用,随着剂量的增加抑制作用增强,显示优化方法的可靠性。米非司酮作为孕酮受体拮抗剂,没有表现出抑制GVBD的效应,证明孕酮诱导爪蟾GVBD并非完全由孕酮受体(PR)介导。同时,来曲唑和咪鲜胺对孕酮诱导爪蟾GVBD没有影响,显示此两种物质在孕酮诱导GVBD过程中不具有内分泌干扰作用。

日本鳗鲡排卵的人工诱导

对日本鳗鲡(Anguillajaponica)卵巢发育的时间与催产率的关系进行研究,对卵母细胞在体内胚泡破裂(GVBD)的发生过程、以及用17α-OHP和17α,20β-DHP诱导日本鳗鲡排卵的方式、时机和催产效果进行观察,结果表明,卵巢发育时间越长,催产率越低。造成催产率低的原因主要是由于日本鳗鲡在卵母细胞成熟后期,雌鳗个体对催产药物敏感性差异较大,催产时机难以掌握。通过采用适合日本鳗鲡卵母细胞的透明液观察GVBD的发生过程,并根据每个个体GVBD的发生速度,制订适宜的催产方案基本解决了上述难题。本实验采用CP、HCG、17α-OHP或17α,20β-DHP混合催产,使其平均催产率由35 4%分别提高到91 9%和93 0%。17α-OHP和17α,20β-DHP的催产剂量为5mg/(500g)和10mg/(500g)。在(21±0 5)℃水温条件下,催产效应时间分别为15～18h和13～16h。

汞对雌性小鼠生殖功能及脏器的影响

为探讨汞化合物对脏器及生殖的毒性,采用卵母细胞体外培养、体外受精的方法研究了汞对小鼠脏器系数、卵母细胞成熟和受精能力的影响。结果表明,0.5和1.5mg/kgBW汞对小鼠的肝脏、肾脏有明显的毒性作用,1.5mg/kgBW组还对卵巢有明显的毒性作用,并能显著降低超排卵的卵母细胞数;汞对体内卵母细胞生发泡破裂没有影响,但可以抑制卵母细胞第一极体的释放,影响卵母细胞的存活率并降低体外受精(IVF)率。结果提示,氯化汞可以影响卵母细胞的成熟,明显破坏卵母细胞的体外受精能力,损伤或降低小鼠的生殖能力。

14-3-3ε和Cdc25B在小鼠卵母细胞生发泡期阻滞中的作用

目的:研究14-3-3ε和Cdc25B对小鼠卵母细胞生发泡(GV)期阻滞作用的影响,为阐明蛋白激酶A/Cdc25B/14-3-3ε通路在小鼠卵母细胞GV期阻滞中发育调控机制奠定基础。方法:在体外将表达载体pcDNA3.1-ZEO-HA14-3-3ε、pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-WT、pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-S321A和pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-S321D转录成mRNA。超排卵方法获得小鼠GV期卵母细胞,实验分为未注射组、TE缓冲液注射组、14-3-3εmRNA单独注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-WT(野生型)mRNA共注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-S321D(模拟磷酸化型)mRNA共注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-S321A(突变型)mRNA共注射组,收集各组母卵细胞后采用Western blotting法检测外源性14-3-3ε和Cdc25B蛋白表达及Cdc2-Tyr15的磷酸化状态;相差显微镜观察卵母细胞的形态学变化并计数生发泡破裂(GVBD)率。结果:未注射组、TE缓冲液注射组、14-3-3εmRNA单独注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-WT(野生型)mRNA共注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-S321D(模拟磷酸化型)mRNA共注射组在显微注射后20h均未发生GVBD(P>0.05);14-3-3εmRNA+Cdc25B-S321A(突变型)mRNA共注射组在显微注射后1、2和3h卵母细胞的GVBD率分别为(5.00±0.68)%、(62.00±3.56)%和(100.00±0.00)%,显微注射后20h到达第2次减数分裂中期(MII)的比例为(79.00±2.80)%,与未注射组和TE缓冲液注射组比较,GVBD率和到达MII的比例均显著升高(P<0.01)。结论:14-3-3ε通过Cdc25B的321位丝氨酸磷酸化和脱磷酸化调控卵母细胞由GV期向GVBD的过渡。

香烟烟雾水溶物对小鼠卵母细胞成熟和IVF的影响

采用小鼠卵母细胞体外培养、体外受精的方法研究不同产地 3种香烟的烟雾水溶物对小鼠卵母细胞成熟和受精能力的影响。结果显示 3种香烟烟雾水溶物对卵母细胞生发泡破裂都没有影响 ,但可以显著地抑制卵母细胞第一极体的释放、降低卵母细胞的体外受精率和体外存活率。结果提示 ,香烟烟雾中影响生殖作用的主要成分是其中的水溶性成分 ,它们可以破坏卵母细胞的成熟、降低卵细胞的受精能力 ,对生殖细胞和生育能力有一定的毒性作用 ;不同产地、不同品牌香烟烟雾水溶物毒性作用相似。

甲醛对雌性小鼠生殖功能及脏器的影响

采用超排卵技术研究甲醛对小鼠卵母细胞的成熟和体外受精以及脏器等的影响。甲醛对小鼠卵母细胞生发泡破裂没有影响,但可以抑制卵母细胞第一极体的释放,影响卵母细胞的存活率和破坏卵母细胞成熟,并可降低体外受精率和超排卵的卵母细胞数量,影响小鼠的正常生殖功能。而且,高剂量的甲醛还对小鼠的肝脏以及卵巢有明显的毒副作用。

6种金属元素对小鼠卵母细胞成熟和体外受精的影响

为研究镉、铅、镍、锰、铬、铝元素的生殖毒性 ,采用卵母细胞体外培养、体外受精的方法 ,观察它们对卵母细胞成熟和受精能力的影响。结果显示除了铝外 ,其它各金属元素均可以明显降低小鼠超排卵数 ;6个剂量组均可以抑制卵母细胞的成熟 ,显著降低卵母细胞第一极体释放率、体外受精率和细胞存活率 ,对体内卵母细胞的生发泡破裂没有影响 ,但是对体外培养卵母细胞的生发泡破裂有明显的抑制作用 (铝组除外 )。结果提示 ,这些金属元素被人体过量吸收后 ,可以破坏育龄妇女卵母细胞正常成熟 ,使受精能力下降 。

三氯化铬对小鼠卵母细胞成熟和体外受精的影响

采用小鼠卵母细胞体外培养 ,体外受精的方法研究了三氯化铬对小鼠卵母细胞成熟和受精能力的影响 .结果表明 ,三氯化铬可以抑制卵母细胞第一极体的释放 ,降低小鼠超排卵数和卵母细胞的存活率和体外受精率 .对小鼠体内生发泡破裂没有影响 ,但可以抑制体外培养卵母细胞的生发泡破裂 ;随着在正常培养液中培养时间的延长 ,卵母细胞的第一极体的释放率和体外受精率 (除了 6.0 mg· kg-1组外 )均有显著提高 ,且与对照组相比已经无显著性差异 .结果提示 ,三氯化铬可以破坏卵母细胞的成熟 ,降低卵母细胞的受精能力 。

卵丘细胞对小鼠卵母细胞体外成熟及其后续发育的影响

观察了卵丘细胞共培养对小鼠生发泡期部分裸露(PNO)和裸卵(NO)成熟和发育能力的影响;分别用小鼠、大鼠、猪的卵丘细胞与小鼠PNO和NO进行了共培养。检测了小鼠PNO和NO的减数分裂能力、生发泡构型、受精和胚胎发育能力。结果,PNO、NO的减数分裂能力显著(P<0.05)低于卵丘完整复合体(COCs)的减数分裂能力。COCs中SN型卵母细胞比率显著高于PNO和NO中SN型卵母细胞比率(P<0.05),大部分PNO和NO的卵母细胞核型为NSN型。与对照组相比,与小鼠或大鼠卵丘细胞共培养的小鼠PNO和NO的减数分裂能力没有显著提高,但是与猪卵丘细胞共培养却可以提高小鼠PNO和NO的减数分裂能力。结果表明,猪卵丘细胞能促进小鼠卵母细胞的体外成熟,但并不影响小鼠卵母细胞的受精和胚胎发育。

雷公藤多甙对小鼠卵母细胞成熟和体外受精的影响

采用超排卵技术研究雷公藤多甙(GTW)对小鼠卵母细胞的成熟和体外受精以及脏器等的影响,GTW对小鼠卵母细胞生发泡破裂没有影响,但可以抑制卵母细胞第一极体的释放,影响卵母细胞的存活率并可降低体外受精率和超排卵的卵母细胞数量。GTW可以破坏卵母细胞成熟,降低卵母细胞的体外受精能力,影响小鼠的正常生殖功能。

褪黑素对FSH诱导的小鼠卵母细胞体外成熟的影响

通过次黄嘌呤(HX)阻滞、FSH诱导体外培养模型研究了褪黑素(MT)对小鼠卵母细胞成熟的影响,探讨褪黑素(MT)是否影响小鼠卵母细胞的体外成熟。0.1mg/mL和0.02mg/mL两有效浓度的MT能显著抑制促性腺激素(FSH)诱导的HX阻滞的CEOsGVBD的发生(P<0.05),对PBl的排出虽有一定的抑制作用,但没有统计学意义;MT和次黄嘌呤(HX)对CEOs的自发成熟有协同抑制作用(P<0.01),但在裸卵(DO)自发成熟的阻滞中没有协同效应。MT是调节哺乳动物卵母细胞成熟的重要激素之一,其作用机制可能是通过卵丘细胞实现的。

鳗鲡繁殖生物学研究:Ⅵ.鳗鲡17α,20β-双羟孕酮的生成和作用

研究了鳗缅卵泡17α，20β-双羟孕酮的生成和它对卵母细胞胚泡破裂的影响．结果表明，注射鲤鱼脑垂体匀浆液和人绒毛膜促性腺激素可诱导性腺发育成熟鳗闻17α，20β-双羟孕酮的生成并导致排卵，但两者单独或结合使用对鳗鲡700～900μm离体卵泡17α，20β-双羟孕酮的生成没有作用，鳗鲡脑垂体匀浆液则能显著刺激700～900μm高体卵泡生成17α，20β-双羟孕酮。17α-羟孕酮能显著增加鳗鲡700～900μm高体卵泡17α，20β-双羟孕酮的生成．5ng／ml和10ng／ml17α，20β-双羟孕酮分别诱导494％±4．3％和84．3％±5.4％的离休卵泡（700～900μm）发生胚泡破裂，而对600～700μm的高体卵泡胚泡破裂无作用．5ng／ml17α，20β-双羟孕酮在24小时内使90．6％的卵泡发生胚泡破裂。经3或9小时50IU／ml人绒毛膜促性腺激素预孵育后，600～700μm的高体卵泡能对5和10ng／ml的17α，20β-双羟孕酮起反应而发生胚泡破裂。

镍对小鼠卵母细胞成熟和体外受精的影响

为了研究镍的生殖毒性 ,采用卵母细胞体外培养、体外受精的方法研究镍对小鼠卵母细胞的成熟和体外受精率的影响。结果 :氯化镍对卵母细胞生发泡破裂没有影响 ,但抑制卵母细胞第一极体的排放 ,降低体外受精率 ,并降低卵母细胞的存活率。实验结果提示 ,氯化镍破坏小鼠卵母细胞的减数分裂 ,影响小鼠的生殖功能。

香烟烟雾水溶物对雌性小鼠生殖毒性的研究

为了研究香烟的生殖毒性 ,采用灌服香烟烟雾水溶物后观察其对小鼠怀孕率和胚胎发育的影响 ,以及取出卵母细胞进行体外培养和体外受精的方法 ,观察香烟烟雾水溶物对超排卵的卵母细胞数目、卵母细胞的成熟和受精能力等的影响。结果表明 ,香烟烟雾水溶物可以极显著地降低小鼠的妊娠率 ,抑制胚胎发育 ,显著性地抑制卵母细胞的体内成熟 ,降低第一极体的释放率和卵母细胞的体外受精率 ,使卵母细胞存活率显著降低。结果还显示 ,香烟烟雾水溶物对小鼠生殖作用的损害和对卵母细胞成熟的抑制作用可能是可逆的 ,停止灌服香烟烟雾水溶物和将卵母细胞以及受精卵培养在正常的培养液中 ,小鼠的生育能力又能基本恢复正常 ,卵母细胞的第一极体的释放率以及体外受精率都明显提高。提示 ,香烟烟雾水溶物可以破坏卵母细胞的成熟和减数分裂 ,降低小鼠的生殖能力和生育能力 ,但这种毒性作用是可以逆转的 ,戒烟后又可恢复正常。香烟中对生殖毒性较大的物质可能是其中的一些含量较高的重金属元素。

6-DMAP对小鼠卵母细胞减数分裂启动及孤雌发育作用

小鼠卵泡卵母细胞体外培养过程中加入2 mmol/L 6-DMAP可抑制卵母细胞自发的染色质浓缩和生发泡破裂(GVBD)。源自超排的MⅡ期卵母细胞则能为6-DMAP所激活。hCG注射后18—19h的卵母细胞置于2 mmol/L6-DMAP的CZB溶液中培养0.5 h、1h、2h、3h,卵母细胞的激活率分别为26.1%、75.2%、75.8%、77.3%、;卵裂率分别为88.2%、73.2%、67.0%、58.4%。与乙醇激活法相比,6-DMAP处理引起了不同的孤雌激活类型。

樟脑丸对雌性小鼠生殖细胞和脏器的影响

目的 :探索由对二氯化苯制成的樟脑的生殖毒性。方法 :采用卵母细胞体外培养、体外受精等方法研究樟脑丸对小鼠卵母细胞成熟和受精能力的影响。结果 :接触樟脑丸 3 d组和 5d组对小鼠的卵巢和肝脏有明显的毒性作用 ,5d组能显著降低超排卵数 ;樟脑丸对卵母细胞生发泡破裂没有影响 ,但抑制卵母细胞第一极体的释放 ,影响其存活率及降低体外受精率。结论 :本实验结果提示 ,樟脑丸可能影响超排卵小鼠卵母细胞的成熟 ,明显降低卵母细胞的体外受精的能力 ,并表现有明显的生殖细胞毒性。

补肾活血方对PCO小鼠未成熟卵母细胞体外核成熟的影响

目的 探讨补肾活血方对PCO小鼠未成熟卵母细胞体外核成熟的影响。方法⑴制备补肾活血方含药血清;⑵制作PCO小鼠模型;⑶将PCO小鼠生发泡(germinal vesicle,GV)期卵母细胞分别在不同采血时间获取的补肾活血方含药血清培养液中进行体外培养,观察补肾活血方含药血清对生发泡破裂(germinal vesicle break-down,GVBD)和第一极体(the first polar body,PB1)排出的时效关系。结果⑴2 h和2.5 h药物血清组卵母细胞GVBD的发生率高于正常血清组和对照组,培养后4 h差异有统计学意义(P<0.01);⑵2 h和2.5 h药物血清组卵母细胞PB1的发生率高于正常血清组和对照组,培养后18 h差异有统计学意义(P<0.01)。结论 2～2.5 h补肾活血方含药血清对PCO小鼠未成熟卵母细胞体外核成熟具有明显促进作用。

铅对小鼠卵母细胞成熟和体外受精的影响

目的 :探讨铅对小鼠生殖作用的影响。方法 :采用小鼠卵母细胞体外培养、体外受精的方法研究了铅对小鼠卵母细胞的成熟和体外受精的影响。结果 :铅对小鼠卵母细胞生发泡破裂没有影响 ,但可以抑制卵母细胞第一极体的释放 ,影响卵母细胞的存活率并可降低体外受精率和超排卵的卵母细胞数量。随着培养时间的延续 ,卵母细胞的第一极体的释放率和体外受精率都有显著提高。结论 :铅可以破坏卵母细胞减数分裂进行 ,降低卵母细胞的受精能力 。

锰对小鼠卵母细胞成熟和体外受精的影响

目的 研究锰的生殖毒性。方法 采用小鼠卵母细胞体外培养、体外受精的方法研究了硫酸锰对小鼠卵母细胞成熟和受精能力的影响。结果 硫酸锰可以抑制卵母细胞第一极体的释放 ,降低小鼠平均超排卵的卵母细胞数和卵母细胞的存活率和体外受精率。对小鼠体内生发泡破裂 (GVBD)没有影响 ,但可以抑制体外培养卵母细胞的GVBD ;硫酸锰还可以抑制受精卵的卵裂。结论 本实验结果提示 ,硫酸锰可以破坏卵母细胞的成熟 ,降低卵母细胞的受精能力 。

表皮生长因子调节小鼠生发泡期卵母细胞发育成熟的实验研究

目的 :观察表皮生长因子 ( EGF)对生发泡期 ( GV期 )卵母细胞生发泡破裂( GVBD)、第一极体 ( FP)形成的影响。方法 :体外培养的昆明种雌性小鼠 GV期卵母细胞分为卵丘卵母细胞复合体 ( COC)组及去卵丘裸卵 ( DO)组 ,观察不同浓度 ( 0、2、5、1 0、1 5μg/ L ) EGF对体外培养 0、4、8、1 2、2 4、3 6、48h COC、DO各组 GVBD、FP形成的影响。结果 :( 1 ) EGF可促进 DO组的卵母细胞成熟分裂 ,培养 48h EGF各组与对照组相比 ,有显著性差异 ( P<0 .0 5) ;( 2 ) COC组培养 3 6h后 EGF各组成熟率均显著大于对照组 ( P<0 .0 5) ;( 3 )不论是否存在 EGF,COC组成熟分裂率均显著高于 DO组 ( P<0 .0 5) ;( 4)EGF作用呈剂量依赖性。结论 :EGF不仅可促进 COC组 GVBD发生、FP形成 ,而且可不通过卵丘细胞直接刺激卵母细胞成熟 ,EGF对 COC促进作用强于 DO,并呈剂量依赖性。