基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD-L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP)序列,构建含有PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株。根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,针对PD-L1基因终止密码子设计两对sgRNA,退火形成双链后连接至Lenti-V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证。对于正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率。根据靶点位置设计左同源臂+GFP+右同源臂序列合成Donor片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证。将验证成功的Lenti-V2-sgRNA和pUC19-donor-GFP共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP表达情况,菌落PCR及基因测序验证GFP报告基因的靶向插入效果。经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD-L1的Cas9载体Lenti-V2-gRNA和含GFP基因的Donor质粒pUC19-donor-GFP构建成功。两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察、多克隆验证、单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP成功转入HT29细胞并进行了表达,经有限稀释法筛选出的单克隆细胞荧光均一,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR均检测到特异条带,表明在PD-L1终止密码子前成功插入了GFP片段,细胞株构建成功。通过基因编辑技术成功构建了稳定表达PD-L1-GFP报告基因的HT29结肠癌细胞株,建立了一个可以直观在细胞上观察PD-L1是否表达以及表达的强弱程度的系统,为后期体内外筛选调控PD-L1的上游新靶点及药物奠定了基础。

用发光酶基因(luxAB)标记法研究慢生花生根瘤菌的竞争结瘤能力

lux AB基因标记是一种新型基因标记技术 ,在很多研究领域都有着良好的应用前景。研究通过三亲本杂交将 lux AB基因成功地向慢生型花生根瘤菌进行了转移 ,并获得了一株带 Lux AB基因标记的菌株Cspr7- 1。对 Cspr7- 1进行性状、标记基因的遗传稳定性检测 ,结果表明 ,Lux AB基因不仅能有效表达 ,而且性状稳定。在无氮水培条件下进行标记菌株与土著根瘤菌的竞争结瘤试验。结果证实 ,Cspr7- 1在植物根系上的占瘤率平均达到 61 .3% ,比土著根瘤菌的竞争结瘤能力强 ,而且 Cspr7- 1在主根上的侵染能力远较侧根上的强 ,平均高出 2 2 .3%～ 39.6%。

GFP基因在新疆小拟南芥和拟南芥中的表达分析

以质粒pMCB30为模板,扩增GFP基因,连接到载体pCMBIA2300-35S-OCS上,构建过量表达载体p35S:GFP,将其转入农杆菌GV3101.通过农杆菌介导法将p35S:GFP载体分别转入新疆特色植物小拟南芥和拟南芥中.T0代经含有卡那霉素的1/2MS培养基筛选,获得了T1代转基因小拟南芥2株,T1代转基因拟南芥9株.通过激光共聚焦显微镜观察,在转基因小拟南芥和拟南芥的根尖细胞中均可检测到GFP绿色荧光蛋白;对转基因植株进行PCR扩增,均可检测到GFP基因,表明GFP基因已成功转入小拟南芥和拟南芥中.该研究建立了小拟南芥的遗传转化体系,为进一步利用GFP基因和进一步研究小拟南芥的功能基因奠定基础.

GFP基因转化香樟胚性愈伤组织的研究

以香樟胚性愈伤组织作为受体,利用根癌农杆菌介导法进行了绿色荧光蛋白基因(GFP)的遗传转化研究。经农杆菌侵染后的胚性愈伤组织通过共培养、选择培养后获得抗性愈伤组织和体胚,对抗性愈伤组织及体胚的诱导过程进行了GFP荧光检测。结果表明,GFP基因能在抗性愈伤组织和体胚中强烈表达,证明GFP基因能够在香樟遗传转化中得到应用。对抗性愈伤组织的PCR检测初步证实外源GFP基因已整合到香樟胚性愈伤组织的基因组中。

用慢病毒载体介导产生绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠

以慢病毒(lentivirus)载体为骨架,携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的假病毒,通过小鼠受精卵卵周隙注射,将其感染小鼠受精卵,经移植于假孕母鼠后获得转基因小鼠．应用PCR、荧光显微镜观察和流式细胞仪分析等技术,证明了GFP基因的整合率达到40％以上;实时定量PCR 分析结果表明转基因小鼠中GFP基因整合的拷贝数约为40;染色体荧光原位杂交分析结果显示 GFP基因在小鼠染色体上的整合是随机的,并通过交配可将外源基因遗传至子代,获得的多整合位点和不同表达水平的转基因小鼠具有明显的实际应用和研究价值．文中报道的慢病毒载体介导的转基因技术为高效制备和选育高表达转基因小鼠品系提供了一种有效的途径．

GFP基因在棉花转化中的应用

以绿色荧光蛋白GFP基因为报道基因，用花粉管通道和农杆菌介导的转化方法将外源基因导入棉花(Gossypium hirsutum L.)，分别获得转化幼胚、幼苗和转化愈伤组织。用手持紫外灯结合显微镜检术能够快速地对转化子进行活体筛选鉴定，比用GUS检测方法有明显的优越性。本研究不但为花粉管通道转化法的可行性提供了新的证据，同时也建立了GFP用于棉花基因工程研究的检测技术体系。

花粉介导法将TaPHR1∷GFP融合蛋白基因导入玉米

利用超声波辅助花粉介导基因转化法,将小麦耐低磷调控基因TaPHR1和GFP构建成的融合蛋白基因(TaPHR1∷GFP)导入3个玉米自交系郑58、昌7-2和PH6WC中.结果表明:3个自交系的转化效果存在基因型差异,郑58是很好的转化受体材料,平均结籽穗率、每穗平均结籽数、BASTA除草剂抗性和转基因植株PCR阳性率均优于昌7-2和PH6W;对T1代植株进行Southern杂交表明,TaPHR1∷GFP融合蛋白基因已整合到玉米基因组中;RT-PCR结果显示,TaPHR1∷GFP融合蛋白基因得到有效转录;通过对发芽籽粒进行GFP荧光观察表明,TaPHR1∷GFP融合蛋白基因得到了表达.

一种应用luxAB基因标记大豆根瘤菌的新方法

研究构建了带有luxAB基因和 parCBA/DE基因的重组质粒 pHN2 0 8,并通过三亲本杂交法将该质粒导入 6株大豆根瘤菌中 ,获得工程菌株。工程菌株在自生条件下和共生条件下的发光稳定性研究结果表明 ,重组质粒 pHN2 0 8可在根瘤菌中稳定传代。比较了工程菌与出发菌株的竞争结瘤能力 ,结果表明 pHN2 0 8的导入不影响根瘤菌的竞争结瘤能力。从而建立了一种更为简便的应用luxAB基因标记大豆根瘤菌的新方法 ,为检测大豆根瘤菌的结瘤情况以及进一步筛选强竞争结瘤大豆根瘤菌提供了一种适用的方法。

luxAB基因标记的K2116L菌株在棉花根际中的定殖

采用三亲本杂交法将发光酶luxAB基因转移进棉花根际促生菌芽胞杆菌K2116菌株中,获得标记菌株K2116L。标记菌株连续传代15次均未发生质粒丢失现象,表明标记菌株具有较好的遗传稳定性;K2116L菌株的生长及其释钾能力未受到标记质粒的影响。K2116L菌株在灭菌和非灭菌的黄褐土、黄潮土和红壤3种土壤中均能长期存活;在灭菌土壤中的数量稍高于非灭菌土壤;在3种土壤中的数量依次为:黄褐土>黄潮土>红壤;在不同土壤中,K2116L菌株具有与土著菌株进行空间和营养竞争的能力。采用根盒试验追踪标记菌株在棉花根部的定殖动态,棉花播种12d时标记菌株在0～2、2～4cm深度根际土壤定殖密度达到最大;18d时在4cm以下的深度达到最高水平。棉花播种18d时标记菌株在所有深度的根表均达到最高定殖水平,0～2cm根段定殖密度为1.76×106cfu.g-1,8cm以下根段达到1.6×105cfu.g-1。补充营养后,根际和根表标记的菌株数量均有明显上升。试验数据显示,随着根的生长标记菌株不断向根尖方向扩散。

马铃薯质体表达载体构建及GFP基因在块茎中的瞬时表达

利用高等植物质体基因组在进化中高度保守的特点,根据烟草质体基因组全序列设计合成引物,PCR扩增并克隆了马铃薯质体的trnI-trnA基因片段。将测序正确的trnI基因和trnA基因作为定点整合外源基因的同源重组片段,构建成包含Prrn-gfp-aadA-TpsbA表达盒的马铃薯质体定点转化载体pBMLSIA-GFP,酶切鉴定表明,所构建载体符合预期设计。采用该载体对马铃薯块茎进行基因枪法转化,结果表明,GFP基因可在质体特异性启动子Prrn及终止子TpsbA的调控下在马铃薯块茎中瞬时高量表达,经基因枪轰击后马铃薯块茎在紫外投射仪下产生很强的绿色荧光,在距离为6cm,压力1100psi轰击2枪的条件下产生的绿色荧光最强。马铃薯块茎可溶性蛋白SDS-PAGE电泳分析表明,GFP蛋白表达量约占总可溶性蛋白的15.4%-30.2%,均达到了较高的表达水平。该载体对后期马铃薯质体转化体系的建立和其他功能基因导入马铃薯质体进行性状改良具有重要应用价值。

利用绿色荧光蛋白GFP作为报告基因检测转基因植物

GFP作为报告分子被广泛地运用在转基因植株检测中。利用PCR技术扩增得到番茄Bax inhibitor-1基因(LeBI-1),亚克隆到含GFP基因的pEGFP载体上,进一步将中间载体构建到植物表达载体pBI121上。重组pBI121-LeBI-1-EGFP经农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草,分化筛选后获得抗性烟草植株。利用GFP作为报告基因,采用PCRs、outhern blot及荧光方法验证外源基因LeBI-1成功转化到烟草中。分析讨论报告蛋白GFP不同检测方法的优缺点。

GFP基因在软枣猕猴桃愈伤组织原生质体中瞬间表达的初步研究

用PEG介导法对游离出来的软枣猕猴桃原生质体进行遗传转化,成功地将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入了原生质体,并获得了瞬间表达.结果表明,影响GFP基因转化的因素主要是材料的生理状态,PEG的种类和浓度;适宜的转化条件和方法为,将从白色、较为疏松愈伤组织中游离的原生质体,悬浮到质量分数为13%甘露醇的洗液(CPW13)中,置于45℃水浴中热激5min,再放在冰浴中迅速冷却;加入质粒,轻轻混匀后静止10min;逐滴加入质量分数40%PEG6000介导转化,终浓度为100g·L-1,在室温下放置20min;逐滴加入CPW13稀释转化后的原生质体,以避免PEG浓度剧烈变化造成细胞膜破裂.

农杆菌介导的Lyz-GFP基因对匍匐翦股颖Penn A-1转化和表达的研究

以匍匐翦股颖Penn A-1成熟胚为供试材料,建立了其植株高效再生体系。利用农杆菌介导法将溶菌酶与绿色荧光蛋白Lyz-GFP双元基因转入匍匐翦股颖Penn A-1胚性愈伤组织中,经培养获得抗病转基因植株。并对Lyz-GFP双元基因转化Penn A-1的适宜条件进行了研究。研究结果表明,在2.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L 6-BA的MS培养基上Penn A-1愈伤组织诱导率最高,可达36%,且质量最好。愈伤组织在MSO+0.5mg/L NAA上分化率最高,达42.5%;浓度为300mg/L的头孢霉素(Cef)可抑制农杆菌LBA4404的生长;Penn A-1胚性愈伤组织经携有pBI121-Lyz-GFP的农杆菌LBA4404(OD600值0.3～0.5)侵染10～15min,共培养3d后,转化愈伤组织生长状况良好,转化率达12.5%,且在后期的生长和转化苗的再生中有良好的表现,转化苗再生率为27.5%;转化植株有较强的荧光表达量,并经PCR检测,获得的2株匍匐翦股颖Penn A-1转化植株中均扩增出750bp的目标基因片断。

以luxAB为报告基因的大豆根瘤菌的竞争结瘤研究

将来自pHN101的luxAB基因和来自pTR102的parCBA /DE基因,经过一系列中间载体整合到PLAFR3上构建成广宿主、稳定性质粒PHN158。通过三亲本杂交将pHN158导入费氏中华根瘤菌得到4株能在癸醛的激发下发出荧光的转移接合子WZRL、HWRL、HZRL和WWRL。将它们与3株大豆慢生根瘤菌WHB1、WHB2和WWB组配成12对组合,并以黑龙33和Williams为宿主以luxAB为报告基因进行竞争结瘤试验。结果表明,费氏中华根瘤菌与大豆慢生根瘤菌之间的平均竞争结瘤能力相当;同类型根瘤菌不同菌株之间的竞争结瘤能力存在着显著的差异;同时根瘤菌的竞争结瘤能力也明显受到宿主的影响。表明费氏中华根瘤菌与大豆慢生根瘤菌之间的竞争结瘤是一个菌株之间、菌植之间复杂的相互作用的过程。

gfP基因甘蓝质体表达载体构建及原核表达分析

以甘蓝自交系‘03097’为试材,PCR扩增并克隆了甘蓝质体的trnI-trnA基因区段,利用该基因区段作为定点整合外源基因的同源重组片段,构建了甘蓝质体定点转化载体,并进行了原核表达分析。结果表明,所扩增的基因区段大小为2.7 kb。进行序列分析后,经酶切、连接和转化,构建成含Prrn-gfp-aadA-TpsbA表达盒的质体表达载体,酶切鉴定表明,所构建载体符合预期设计;gfp基因能够在质体特异性启动子Prrn及终止子TpsbA的调控下高水平表达,表达量约占总可溶性蛋白的41.0%,包涵体占菌体蛋白的38.0%。该载体的构建为后期甘蓝质体转化体系的建立和其它功能基因导入甘蓝质体进行性状改良奠定了基础。

差速贴壁法纯化分离GFP转基因小鼠骨髓间充质干细胞

目的运用差速贴壁法分离纯化绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)。方法分离GFP转基因小鼠骨髓细胞直接种植在培养瓶中,分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、24h和48h进行首次全量换液,培养3d后按细胞类型对贴壁细胞分别计数,并用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。另外,选4h、8h、24h后换液的细胞进行传代培养,传至第5代,计算扩增倍数,用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。结果随着首次换液时间的延长,贴壁细胞密度增多,BMSCs的比例减少。首次换液时间在接种后2h的细胞纯度高,但细胞密度低;24h后的细胞密度高而纯度低;8h后的细胞密度大具有较高的纯度。传代后的GFP转基因小鼠BMSCs能稳定表达GFP。结论差速贴壁法能有效分离纯化GFP转基因小鼠BMSCs,首次换液时间在接种后8～10h时的传代细胞纯度高,具有扩增能力,可作为组织工程和基因治疗研究的种子细胞。

荧光假单胞菌AS1.867和3-PHB的luxAB基因标记及其在小麦根际的定殖

通过三亲本杂交方法成功地用发光酶基因 lux AB标记荧光假单胞菌 ( Pseudomonasflu-orescens) AS1 .86 7- L和 3 - PHB菌株 ,获得的标记菌株 AS1 .86 7- L和 3 - PHB- L在不同的条件下能稳定发光。将 AS1 .86 7- L和 3 - PHB- L制成固体微生物接种剂 ,并利用土壤微缩系统将其接种于小麦 ,研究它们在小麦根际的定殖动态和散布规律。结果发现 ,二株标记菌株在灭菌土壤上的定殖水平高于不灭菌土壤 ,在垂直方向上定殖主要发生于 0～ 8cm根段间 ,且随着深度的增加而降低。接种菌株在第 7天之前就已达到最高定殖水平 ,在每克根的初始接种量为 2 .3 2× 1 0 8cfu时 ,第 7天的灭菌土壤中 AS1 .86 7- L和 3 - PHB- L的根际菌数分别为 9.6 7× 1 0 6cfu和 6 .90× 1 0 6cfu,不灭菌土壤的根际菌数为 1 .41× 1 0 5cfu和 7.71× 1 0 5cfu。随着时间的延长 ,定殖数量均明显降低 ,3 - PHB- L在 40

农杆菌介导GFP基因转化苹果茎尖碎片获得转基因植株

【目的】为解决基因型依赖性比较强的苹果品种遗传转化困难等问题,研究不同伤害处理方式下苹果茎尖碎片的再生能力及其对苹果转化率的影响。【方法】以苹果‘姬神’试管苗为试材,运用农杆菌介导法对苹果茎尖和离体叶片进行遗传转化。【结果】将茎尖纵切为4部分时,可以高比率的形成愈伤组织(88.4%)和再生不定芽(59.8%)。在20 mg·L-1的卡那霉素筛选压下,300个茎尖外植体中有50.4%的茎尖碎片形成愈伤组织并获得了19株表达GFP的转基因植株。而在同样的筛选压下有22.6%农杆菌介导的离体叶片形成愈伤组织,但不能获得转基因植株。降低筛选压可以提高植株再生率,但其中包含大量嵌合体,转化效率并没有明显提高。【结论】苹果茎尖做为转化受体基因型依赖性较低,要优于苹果离体叶片。

一株克服地黄连作障碍有益菌的鉴定及其LuxAB基因标记

[目的]研究对克服地黄(Rehmannia glutinosa)连作障碍有益的43号菌的性质及其对地黄连作障碍的作用效果。[方法]利用细菌16S rDNA的保守序列进行比对,结合形态学观察、革兰氏染色和生理生化等特征对筛选得到的能够克服地黄连作障碍的43号菌进行鉴定;利用LuxAB发光酶基因对其进行标记,经抗性平板筛选,滴加葵醛在暗室进行检测,看是否得到了重组菌株;比较标记前后菌株对培养基中加入生地提取液的组培苗的作用效果。[结果]鉴定结果表明,43号菌为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。检测结果表明,得到重组菌株,命名为C-43。经过比较,标记前后菌株的生理生化特性基本没有变化,确定C-43对克服地黄连作障碍仍然有益。[结论]经过标记后的恶臭假单胞菌C-43号菌可用于后续的大田研究。