大熊猫父权认定的DNA指纹图分析

本文以大熊猫１４胎次，１９只幼子，２５只次雄兽个体的被毛、血液、精液、福尔马林固定的器官组织、粪和尿等为材料作了ＤＮＡ指纹检测。（１）同一大熊猫个体的被毛、血液、精液、固定组织及粪、尿检测，其ＤＮＡ指纹图完全一致。（２）大熊猫无论１雄配１雌，２雄配１雌、３雄配１雌，甚至４雄配１雌，受配雌兽所产任一子代个体的ＤＮＡ指纹图谱中，杂交谱带均分别来自父亲、母亲，以及父母双亲，没有新带出现，无误地认定了１９只幼子的真正父亲，排除了非父。（３）３只大熊猫雌兽的５个双胞胎，即１０只子代个体的ＤＮＡ指纹图谱，均具有个体特异性，表明为异卵双生，其中４个双生子为异卵异父双生，为大熊猫在一个发情期不一定同时排卵提供了佐证，亦为圈养雌兽发情高峰期用多只雄兽作多次配种或输精，能提高受孕产仔率提供了理论和应用依据。（４）ＤＮＡ指纹技术用于大熊猫的亲子鉴定，灵敏稳定，准确无误，为圈养大熊猫多雄配１雌，增加受配雌兽的受孕机会，提高产子率提供了鉴别手段，解除了多雄配１雌，其子代的父亲是谁的后顾之忧。（５）应用寡核苷酸探针ＬＺＦ－１作大熊猫亲子鉴定较ＪＨ１２．

大熊猫亲子鉴定──DNA指纹技术的应用

以大熊猫１０个家系，２０只个体的被毛为材料，辅以血液、精液，作ＤＮＡ指纹图谱的对比分析，结果表明：在同一大熊猫个体的被毛和血液、被毛和精液，血液与精液组织检测，其ＤＮＡ指纹图谱完全一致；大熊猫多雄配一雌及一雄配一雌，所产任一子代个体的ＤＮＡ指纹图谱中，其杂交带都分别来自父亲和母亲，或父母亲，没有新带出现，准确无误地确定了１０个家系子代的真父，排除了非父；三只大熊猫双胞胎中６只子代个体的ＤＮＡ指纹图谱，均具个体特异性，表明都为异卵双生子，为大熊猫在一个发情期不一定同时排卵提供了佐证，亦为圈养雌兽在一个发情高峰期多次配种，提供了应用和理论依据；ＤＮＡ指纹技术用于大熊猫的亲子鉴定，灵敏度高，稳定，重复性好，为圈养大熊猫多雄配一雌，增加受配雌兽的受孕机会，提高产仔效率提供了鉴别手段，解除了多雄配一雌其子代的父亲是谁的后顾之忧。

凉山山系、小相岭山系大熊猫遗传多样性的DNA指纹比较分析

利用同位素标记大熊猫ＤＮＡ指纹探针Ｆ２ＺＧＰ９６０６０８０１，比较检测了凉山山系和小相岭山系大熊猫随机个体的ＤＮＡ指纹图，获得的遗传多样性参数如下：（１）凉山山系和小相岭山系随机个体的平均谱带数分别是３３．１４和２８．２５条；平均等位基因频率分别是０．４３和０．４８；平均杂合率分别是５７％和５２％。（２）凉山山系和小相岭山系大熊猫各自群体内部个体之间ＤＮＡ指纹的相似系数分别是０．６８和０．７２。将两个山系并为一个大群体后，随机个体的平均谱带数为３０．５３；平均等位基因频率为０．３６；个体之间ＤＮＡ指纹的相似系数为０．５８；平均杂合率上升至６４％。（３）凉山山系和小相岭山系大熊猫群体之间的遗传距离为０．４２，两山系之间已有明显的遗传分化。大熊猫以分布的山系为群体单元时，个体之间遗传相似性高，遗传多样性贫乏；若群体单元扩大到两个山系时，个体之间遗传相似性下降，遗传多样性明显上升。此结果初步表明：大熊猫作为一个物种，遗传多样性可能不是很贫乏，但各个山系内的大熊猫群体，遗传多样性的贫乏程度是相当严重的。

荧光素及同位素标记LZF-1探针用于大熊猫亲子鉴定的DNA指纹图分析

以大熊猫４个家系，３０只次个体的被毛、皮肤和福尔马林固定的肝组织作材料，用荧光素（１１－ｄＵＴＰ）和同位素（γ－３２Ｐ－ＡＴＰ）分别标记寡核苷酸探针ＬＺＦ－１，作ＤＮＡ指纹图谱检测．结果表明，无论２雄配１雌、３雄配１雌，甚至４雄配１雌，受配雌兽所生子代的ＤＮＡ指纹图谱条带，均来自父亲、母亲及父母双亲，没有新的条带出现，准确认定了４个家系中６只子代个体的真父，排除了非父．在２个一胎二子的认定中，大熊猫的异卵异父双生的发现，可为大熊猫圈养繁殖配种时。

大熊猫父权确定的DNA证据

本文对成都大熊猫繁育研究基地、成都动物园、福州大熊猫研究中心及昆明动物园圈养繁殖的大熊猫１４胎次、１９只幼子、２５只次参配雄兽个休的被毛、血液、精液、肝、甲醛固定组织细胞，以及粪、尿等样品，采用同位素与荧光素标记基因探针作ＤＮＡ指纹图谱分析，得到了一些有意义的结论：（１）同一大熊猫个体的被毛、血液、精液、肝、甲醛固定组织细胞及粪、尿检测，其ＤＮＡ指纹图完成一致。（２）大熊猫一雄配一雌．或多雄配一雌，受配雌善所产任一个子代个体的ＤＮＡ指纹条带，均分别来自父亲、母亲．以及父母双亲，没有新带出现，无误的确定了１９只子代的真正父亲．排除了非父。（３）５个双胞胎，即１０只子代个体的ＤＮＡ指纹图谱，均具个体特异性，表明为异卵双生，其中４个双生子个体为异卵异父双生，为大熊猫在一个发情期不一定同时排卵提供了佐证，亦为多雄配一雌，以及多次配种提供了理论和应用依据。（４）ＤＮＡ指纹技术用于大熊猫的父权认定，灵敏稳定．准确无误。（５）应用寡核苷醚基因探针ＬＺＦ—ｌ作大熊猫亲子鉴定较ＪＨ１２．６探针更为适合。（６）荧光素及同位素标记探针ＬＺＦ—ｌ其效果基本一致。因此荧光素标记可以取代同位素３２Ｐ标记方法。

大熊猫DNA指纹在野生种群数量调查中的应用

本文用荧光素标记ＬＺＦ－１基因指纹探针，以四川省冕宁县冶勒野外大熊猫的脱落被毛及尽量新鲜的粪便作样品，进行了ＤＮＡ指纹检测。１．在相同或不同时间、巢域采集的粪便与被毛样品，显现出相同或不同的ＤＮＡ指纹图谱，达到个体认定的目的．表明了大熊猫野外脱落被毛和粪便，能作为ＤＮＡ指纹分析材料，进行野生种群数量调查．２．根据检测６个被毛和９个粪便样品的结果，认定该生境中有７只大熊猫个体，纠正了有８只和８±２只的记载．３．应用ＤＮＡ指纹技术及微机个体识别进行大熊猫野外数量调查，准确可靠，节省人力、物力和财力，能获得大熊猫在野外的真实个体数量。

大熊猫DNA指纹分析材料的初步研究

以圈养大熊猫４个家系，１３只个体的３１份粪便、尿液以及甲醛固定的睾丸组织等作材料，辅以血液、被毛进行ＤＮＡ指纹分析。结果表明，同一个体的血液、被毛、粪便、尿液，以及甲醛固定的睾丸组织材料的ＤＮＡ指纹图谱完全一致．使用两种寡核苷酸探针重复验证圈养大熊猫５胎６仔的父子关系，效果稳定。

佛坪三官庙地区大熊猫种群数量的DNA指纹分析

应用同位素标记大熊猫基因指纹探针Ｆ２ＺＧＰ９６０６０８０１，以秦岭南坡中段佛坪国家级大熊猫自然保护区三官庙范围内采集的大熊猫粪便样品作材料，进行了ＤＮＡ指纹检测．（１）在相同或不同时间、领域采得的粪便样品，显现出相同或不同的ＤＮＡ指纹图谱，达到个体认定的目的，进一步表明了大熊猫的尽量新鲜的粪便，可以作为ＤＮＡ指纹分析材料，进行野生种群数量调查．（２）根据检测２１个粪便样品的结果，无误地认定了三官庙地区有１３只大熊猫个体．其中有３个家系．（３）大熊猫粪便样品的ＤＮＡ指纹图，通过微机识别的个体数，准确可靠，能获得大熊猫在野外的真实个体数量．

利用LZF－1DNA指纹探针进行家系的父权鉴定

ＬＺＦ－１ＤＮＡ指纹探针经同位素γ－３２Ｐ－ＡＴＰ标记后，检测了４个家系１３个个体血样的ＤＮＡ指纹．结果表明，父母的遗传物质在子代中的传递符合孟德尔遗传规律，无误地确定了４个家系中的亲子血缘关系．ＬＺＦ－１ＤＮＡ指纹探针在亲权鉴定中的父权概率是０．９９９６４。

大熊猫基因指纹探针F_2ZGP96060801的研制及比较实验分析

利用ＡＢＩ－３９４型ＤＮＡ合成仪合成的寡核苷酸５′－［Ａ（Ｘ）ｎ－１ＴＣＣＡＣ］ｎ－３′，经高效液相色谱仪纯化后，制备成了命名为Ｆ２ＺＧＰ９６０６０８０１的大熊猫基因指纹探针。用同位素标记法标记Ｆ２ＺＧＰ９６０６０８０１、ＬＺＦ－Ⅰ、３３．１５、３３．６和（ＣＡＣ）５／（ＧＴＧ）５等５种基因指纹探针，比较检测了大熊猫随机个体的被毛、大熊猫３雄配１雌所产１个双胞胎计６只个体的福尔马林固定的肝组织和粪便中的胃肠道上皮脱落组织，以及粪便中细菌样品的基因指纹。结果表明：（１）在大熊猫随机个体检测中，Ｆ２ＺＧＰ９６０６０８０１、ＬＺＦ－Ⅰ、３３．１５、３３．６和（ＣＡＣ）５／（ＧＴＧ）５探针检出的平均谱带数分别是３２．３７５、１７．６２５、１４．１２５、１２．６２５和１０．７５条，探针在随机个体中的鉴别机率分别是１．８３×１０－１０、１．３６×１０－８、４．０８×１０－８、４．２１×１０－７和３．１６×１０－７。表明了制备的大熊猫基因指纹探针Ｆ２ＺＧＰ９６０６０８０１在大熊猫物种的个体识别检验中，具有最强的鉴别能力。（２）在亲子鉴定检测中，Ｆ２ＺＧＰ９６０６０８０１、ＬＺＦ－Ⅰ、３３．１５、３３．６和（ＣＡＣ）５／（?

大熊猫种群数量调查方法的新突破

作者应用寡核苷酸基因ＬＺＦ－Ｉ和Ｆ２ＺＧＰ９６０６０８０１探针，对野生大熊猫粪便样品材料作ＤＮＡ指纹图分析，确认大熊猫野生种群的个体数量和家系，获得了满意的结果。文章还介绍了在不同自然保护区、山系或行政区域内，大面积上作大熊猫的种群数量调查采用的方法：Ａ在已知大约数量时，则以１∶５采集粪便样品为宜；Ｂ在未知数量及密度时，则以面积和路线法布点，采集粪样，避免遗漏，影响真实的种群个体确切数量；Ｃ利用空白地形图标注粪样编号，用以核对大熊猫的数量、家系、领域以及每只个体的性别与大致年龄结构，便于评估大熊猫的数量、分布、栖息地的质量与发展趋势，有利于制定保护管理规划，更好地保护大熊猫物种。本法突破了现有陆生哺乳动物数量调查方法，并具有推广和应用价值。

A family net of giant pandas in the Tangjiahe Natural Reserve:Assessment of current individual migration

In the present study, formalin-fixed feces, oli-gonucleotide fingerprinting and SRY-gene based sexing were used to construct a family net for giant pandas in the Tang-jiahe Natural Reserve and to assess contemporary gene flow (migration) in this population. A total of 124 fecal samples were attributed to 37 individuals (22 females and 15 males) that were then analyzed for family relationships. Based on DNA fingerprints, the deduced family net revealed the fol-lowing facts: (i) First-order relatives possessed similarities from 50% to 90%, and similarities between unrelated indi-viduals or distant relatives were as high as 77%, indicating that the Tangjiahe pandas are characterized by high genetic similarity; (ii) 15 matings were identified and 5 ones oc-curred between close relatives, implying that there is poten-tial for inbreeding to impact the pandas; (iii) four mating pairs and 5 offspring presented long distance migrations, demonstrating the intra-reserve habitat is continuous; (iv) four pairs of full sibs (also female-male dyads) dispersed short distance and all of them gave birth to highly inbred offspring, reflecting long distance migration is vital for in-breeding avoidance; (v) 17 adult individuals dispersed short or moderate distance and formed three clusters on the land-scape, indicating that it is necessary to find out whether there is a negative factor impacting the pandas.