大熊猫轮状病毒CH-1株外衣壳蛋白(VP7)基因的克隆和生物信息学分析

为研究大熊猫轮状病毒(Giant Panda Rotavirus,GPRV)CH-1株外衣壳蛋白VP7基因的结构及功能,用MA-104细胞(恒河猴胎猴肾细胞)增殖GPRV,提取总RNA,运用RT-PCR扩增VP7基因,并测序,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果显示成功获得了长1042bp的GPRV VP7蛋白基因(GenBank登录号GU188284)。经生物信息学分析,此序列包含1个981bp的完整开放阅读框,编码326个氨基酸;预测GPRV VP7蛋白理论相对分子质量为37354.8u,等电点为4.76,半衰期为30h,不稳定系数为26.71,总平均亲水性为-0.015,疏水性介于-2.344～3.567;1—24位氨基酸可能是信号肽序列;跨膜结构分析表明VP7蛋白有2个跨膜区,其N端和C端都位于病毒膜外区;抗原表位预测显示VP7蛋白有12个抗原决定簇;结构预测显示其可能包含2个N-糖基化作用位点,5个蛋白激酶C磷酸化作用位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点、1个酪氨酸激酶磷酸化作用位点、4个N-豆蔻酰化位点、1个原核膜脂蛋白脂附着点和1个革兰氏阳性球菌表面蛋白‘锚’六肽。系统进化树分析显示GPRV VP7基因与人A组轮状病毒VP7基因的进化距离最近。本研究成功获得了GPRV VP7基因,为今后研究此基因的生物学功能以及建立该病毒的诊断方法奠定基础。

大熊猫轮状病毒CH-1株研究进展

轮状病毒(Rotavirus,RV)是引起婴幼儿及幼龄动物急性腹泻甚至死亡的重要病原。2009年,首次在幼龄大熊猫粪便中分离到RV,被确定为A组,并将其命名为大熊猫轮状病毒(Giant Panda Rotavirus,GPRV)CH-1株。GPRV CH-1株主要感染断奶后的大熊猫,引起急性传染性、顽固性腹泻甚至死亡,这对大熊猫的健康造成了严重的危害。本文介绍了GPRV CH-1株的基因结构和病毒蛋白结构及其生物信息学分析学以及该病的诊断方法和防治措施,以期为该病致病机制及疫苗研究提供参考。

三种融合标签对大熊猫轮状病毒结构蛋白VP6-VP7可溶性表达的影响

大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus,GPRV)是引起幼龄大熊猫腹泻的主要病原,对圈养大熊猫产生了较大的危害。轮状病毒结构蛋白VP6是一种载体蛋白,可介导黏膜免疫反应。VP7是轮状病毒结构蛋白中主要的中和抗原。因此,VP6-VP7的融合表达作为候选抗原对该病的防治具有重要的意义。传统大肠埃希菌原核表达存在表达量低、可溶性差以及纯度低等弊端。本研究使用醛缩酶(EDA)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)3种融合标签,以实现获得表达量高和纯度高的GPRV-VP6-VP7重组表达蛋白。将扩增的 VP 6、 VP 7基因片段利用同源重组酶构建到含3种融合标签的表达载体pET21b上,将重组质粒转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)感受态细胞中进行低温诱导表达。用Ni-柱亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Image J分析蛋白表达量和可溶性,Western blot分析得到表达的重组表达蛋白正确且具有蛋白活性。实验结果证明,EDA标签能显著促进VP6-VP7蛋白的原核可溶性表达,提高VP6-VP7蛋白表达量。

大熊猫幼兽腹泻粪便分离出的轮状病毒鉴定

11只5～11月龄的断奶大熊猫幼兽先后患一种急性传染性、顽固性腹泻病,1只大熊猫幼兽在发病4d后死亡,相同饲养条件下由母兽哺育的同龄大熊猫幼兽未见发病。取发病大熊猫幼兽粪便、血液以及呕吐物进行细菌学和寄生虫学检查,未检出病原;用轮状病毒粪便抗原ELISA快速诊断,受检的8只大熊猫幼兽腹泻便都多次检出阳性结果。采集发病大熊猫的病料进行病毒病原分离,从腹泻大熊猫幼兽的粪便中分离出病毒颗粒,通过电镜形态、理化特性和中和试验鉴定,确认分离病毒为轮状病毒。

大熊猫源轮状病毒CH-1株VP3基因的克隆与生物信息学分析

为了研究大熊猫轮状病毒VP3基因,为以后研究此基因的生物学功能、建立该病毒的检测方法以及研制新型大熊猫轮状病毒基因疫苗奠定基础,试验采用MA-104细胞培养增殖大熊猫轮状病毒CH-1株,提取总RNA,运用RT-PCR扩增外衣壳蛋白VP3基因,将其与p MD19-T Simple载体连接并转化DH5α,经PCR扩增和测序分析进行鉴定,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果表明:成功获得大熊猫轮状病毒VP3蛋白基因,长为2 591 bp,包含1个2 508 bp的开放阅读框,编码835个氨基酸,测序结果在Gen Bank中的登录号为HQ641295。VP3蛋白基因编码产物分子质量为97 937.91 u,最大疏水指数为2.256,最小疏水指数为-3.000;无信号肽序列;无跨膜结构;在线预测VP3有37个抗原表位;预测其可能包含10个N-糖基化位点,1个c AMP-c GMP独立蛋白激酶磷酸化位点,20个蛋白激酶C磷酸化作用位点,18个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点,1个酪氨酸激酶磷酸化作用位点,5个N-豆蔻酰化位点。大熊猫轮状病毒的VP3基因与猪轮状病毒VP3基因的进化距离最近。

大熊猫轮状病毒可视化LAMP检测技术的建立及应用

根据大熊猫轮状病毒CH–1株VP4基因设计3对引物,建立大熊猫轮状病毒可视化环介导等温扩增(LAMP)检测技术,对其反应条件进行优化及特异性和灵敏度进行验证。结果表明:用可视化LAMP方法检测大熊猫轮状病毒时,在62℃条件下,反应体系中加入终浓度为8 mmol/L Mg^2+、0.6 mol/L甜菜碱、12 U Bst DNA聚合酶和1×LAMP可见光染料,扩增40 min后,阳性样本颜色由紫色变为蓝色,电泳分析扩增产物可观察到明显的梯状条带;用建立的LAMP方法对大熊猫轮状病毒进行扩增,特异性好;其批内及批间的变异系数均小于1%,重复性好;其最低检测限为5×10^–5 ng/μL RNA,灵敏度比常规PCR高约100倍;采用该方法检测50份大熊猫粪便样的轮状病毒,共检测到阳性样本22份,比常规PCR方法检测到的阳性样本多5份,与荧光定量PCR方法的吻合度为100%。可见,用LAMP方法检测大熊猫轮状病毒具有操作简便、反应时间短、特异性强、结果判定快速等特点,可用于临床上大熊猫轮状病毒的快速检测。

幼龄大熊猫轮状病毒感染性腹泻的防治

对幼龄大熊猫轮状病毒感染性腹泻的发病特点、临床表现、流行病学资料进行了简要介绍,通过多年对该病的临床治疗与跟踪观察,对幼龄大熊猫轮状病毒感染性腹泻的临床治疗方法与预防措施进行了详细阐述。

大熊猫轮状病毒PCR检测方法的建立及应用

轮状病毒是威胁大熊猫健康的主要病原微生物之一。为了对大熊猫轮状病毒进行快速、方便且准确地检测,研发适合于基层饲养单位和保护区的检测方法是非常有必要的。本研究通过合成大熊猫轮状病毒Vp7基因序列,构建了PUC-VP7的重组质粒,并将其作为阳性对照对大熊猫轮状病毒样本进行PCR检测和分析。结果表明,在进行PCR扩增分析时,该质粒和病毒cDNA二者均在340 bp处出现了特异性条带。此外,对收集到的45份大熊猫粪便样本进行轮状病毒抗原检测时,其中2份样品在340 bp处出现条带,该基因片段与大熊猫轮状病毒CH-1株的相似性为99.89%。本研究构建的PUC-VP7质粒不但可以作为大熊猫轮状病毒PCR检测中的阳性质控品,而且还能有效地促进该PCR病毒检测技术在基层饲养单位和保护区的推广和应用。

大熊猫轮状病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的大熊猫轮状病毒(RV)VP7基因序列,设计了1对特异性引物,建立了快速检测大熊猫RV的RT-PCR方法。用该方法对MA-104细胞增殖的大熊猫RV进行RT-PCR扩增,结果得到与试验设计相符的342bp的特异性扩增条带,而对传染性胃肠炎病毒、大肠杆菌和沙门氏菌的扩增结果为阴性。测序比对结果证实该体系检测结果准确;该方法最低可检测出约1pg的病毒核酸;重复性试验结果显示,其检测重复性好,提示该RT-PCR方法可用于大熊猫RV的临床快速检测。

大熊猫轮状病毒CH-1株外衣壳蛋白VP4基因的克隆与生物信息学分析

利用MA-104细胞培养增殖大熊猫轮状病毒CH-1株,提取总RNA,运用RT-PCR扩增外衣壳蛋白VP4基因,将其与pMD19-T simple vector连接并转化DH5α,经PCR扩增和测序分析进行鉴定,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果显示,成功获得大熊猫轮状病毒VP4蛋白基因,长2 362bp,包含一个2 331bp的开放阅读框,编码776个氨基酸,测序结果在GenBank中的登录号为HQ641296。生物信息学分析表明,VP4蛋白基因编码产物分子质量为86 768.8u,理论等电点为5.56,半衰期为30h(体外哺乳类网状细胞),不稳定系数为28.64,脂肪指数为82.53,总平均亲水性为-0.265,最大疏水性为2.244,最小疏水性为-2.911;无信号肽序列;跨膜结构分析显示VP4蛋白无跨膜区,位于病毒膜外区;在VP4序列中的抗原决定簇主要位于VP4的N-末端和C-末端。预测其可能包含8个N-糖基化作用位点,15个蛋白激酶C磷酸化作用位点、15个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点、12个N-豆蔻酰化位点。系统进化分析显示,大熊猫轮状病毒的VP4基因与猪轮状病毒的VP4基因的进化距离最近。本试验成功获得大熊猫轮状病毒VP4基因,为以后研究此基因的生物学功能、建立该病毒的检测方法以及研制新型大熊猫轮状病毒基因疫苗奠定了基础。

大熊猫轮状病毒CH-1株NSP4基因的克隆与生物信息学分析

用MA-104细胞增殖大熊猫轮状病毒(RV),并提取总RNA,经RT-PCR扩增,获得NSP4基因,将其克隆到载体进行测序,应用生物信息学方法初步分析NSP4基因的结构及功能,并与不同动物的RV构建系统进化树。结果显示,获得了长750bp的大熊猫RVNSP4基因,此序列包含1个528bp的完整开放阅读框,编码175个氨基酸;预测大熊猫RVNSP4基因的理论分子质量为20223.7u,等电点为6.84,半衰期为30h,不稳定系数为30.40,总平均亲水性为-0.240,疏水性为-2.400～2.622;无信号肽序列;跨膜结构分析表明,NSP4有1个跨膜区,其N端位于病毒膜外区,C端位于病毒膜内区;抗原表位预测显示,NSP4有6个抗原决定簇;结构预测显示,其可能包含2个N-糖基化作用位点、6个蛋白激酶C磷酸化作用位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点和1个酪氨酸激酶磷酸化作用位点;系统进化树分析显示,大熊猫RV NSP4基因与猪RV NSP4基因的进化距离最近。

大熊猫轮状病毒CH-1株VP1基因的克隆和生物信息学分析

为研究大熊猫源轮状病毒(RV)CH-1株外衣壳蛋白VP1基因的结构及功能,采用MA-104细胞增殖大熊猫源RV,提取总RNA,运用RT-PCR扩增VP1基因,将阳性克隆进行测序,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果显示,成功获得了长3 287bp的GPRV VP1蛋白基因(GenBank登录号:HQ641297);经生物信息学分析,此序列包含有一个3 267bp的完整开放阅读框,编码1 089个氨基酸;无信号肽;无跨膜区,其整个蛋白都位于病毒膜外区;抗原表位预测显示VP1蛋白有41个抗原表位;系统进化树分析显示大熊猫轮状病毒CH-1株VP1基因与猪A组轮状病毒VP1基因的进化距离最近。本研究成功获得了大熊猫源RV VP1基因,为今后研究此基因的生物学功能奠定了基础。

SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR检测大熊猫轮状病毒的比较研究

为确定一种准确快速检测大熊猫轮状病毒的方法,同时监测大熊猫轮状病毒的感染情况,通过SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR检测2011至2015年(除2014年)大熊猫基地A和B共227份大熊猫粪便中的轮状病毒。结果显示,利用荧光定量RT-PCR方法检测出25份阳性粪便样品,阳性率为11%(25/227);利用常规RT-PCR检出15份阳性粪便,阳性率为6.6%(15/227),表明荧光定量RT-PCR更适用于大熊猫轮状病毒的检测。在大熊猫基地A,2011—2013年未检出轮状病毒阳性样品,而2015年6月检出10份阳性样品,阳性率为13.5%(10/74),表明该基地的轮状病毒未被净化;在大熊猫基地B,2011—2013年平均阳性率为19%(12/63),2015年阳性率降至12%(3/25),表明近年轮状病毒在大熊猫中带毒情况逐年缓解。