参豉糖蛋白提取工艺优化及纤溶活性研究

[目的]对参豉中糖蛋白的提取工艺进行考察,并对其纤溶活性进行评价。[方法]以糖蛋白提取率为指标,通过单因素法考察缓冲液、提取温度、料液比、提取时间和提取次数对其的影响,并运用响应面法分析优化参豉糖蛋白的提取工艺,采用蒽酮-硫酸法测定糖蛋白中多糖含量,SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳确定糖蛋白的分子量,利用琼脂糖纤维蛋白平板法测定纤溶活性。[结果]缓冲液、提取时间和料液比对糖蛋白提取率影响较大;响应面法优化获得参豉糖蛋白的最佳提取工艺条件为Tris-Base-NaCl缓冲溶液(pH=8.04)、料液比1∶10(g∶mL),于4℃提取6 h,参豉糖蛋白提取率为4.85%,其中多糖含量为12.34%;SDS-PAGE、Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,参豉糖蛋白分子量为4.1~27.0 kD;与豆豉糖蛋白相比,参豉糖蛋白纤溶活性提高了40.6%。[结论]经验证利用响应面法分析测得参豉糖蛋白与模型预测值接近,可用于参豉糖蛋白的提取,且参豉糖蛋白具有较高的纤溶活性,为其进一步开发利用提供依据。

人参糖蛋白对小鼠学习和记忆能力的影响

目的：确定人参糖蛋白的基本化学组成,探讨其对东莨菪碱所致小鼠学习和记忆障碍的影响。方法：采用中空纤维超滤设备,对已除去皂苷的人参水提取物进行分离。采用苯酚硫酸法测定总糖含量,Lowry法测定蛋白含量,高效液相色谱法（HPLC）测定人参糖蛋白的纯度和相对分子质量,将人参制备成1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生物后进行单糖组成分析。注射东莨菪碱建立小鼠记忆获得障碍模型,60只小鼠随机分为对照组（正常小鼠）,模型组（训练后腹腔注射氢溴酸东莨菪碱2.5mg·kg-1）,阳性药组（训练前灌胃给药吡拉西坦9 mg·kg-1,30d）,低、中、高剂量人参糖蛋白组（训练前灌胃给药,剂量为7.5、75.0、225.0mg·kg-1）,每组10只。水迷宫实验测定各组小鼠逃避潜伏期;跳台实验测定小鼠跨平台次数。结果：人参糖蛋白总糖质量分数为58.41%,由7种单糖组成,其蛋白质量分数为19.93%,由17种氨基酸组成。人参糖蛋白相对分子质量分布在200-50 000。Morris水迷宫实验,从第3天开始,与模型组比较,高剂量人参糖蛋白组小鼠平均逃避潜伏期明显缩短（P〈0.05）,跨平台次数明显增加（P〈0.01）。在对位训练中,与模型组比较,高剂量人参糖蛋白组小鼠60s内在平台所在象限s的时间明显延长（P〈0.01）,从第2天起,与模型组比较,低、中和高剂量人参糖蛋白组小鼠平均逃避潜伏期明显缩短（P〈0.05）。在跳台实验中,与模型组比较,低、中和高剂量人参糖蛋白组小鼠3min内的错误次数明显减少（P〈0.05）,中剂量人参糖蛋白组小鼠停留在平台上的潜伏期明显延长（P〈0.05）。结论：人参糖蛋白具有提高小鼠记忆能力的作用。

人参糖蛋白的结构及其镇静安眠作用研究

从人参水提取物部分分离得到糖蛋白组分,此糖蛋白中性糖含量为37.27%、蛋白含量为53.98%、酸性糖含量为10.45%。高效液相色谱法测定重均分子量为17 731u的混合物。糖链部分由6种单糖组成,鼠李糖(Rha)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)与半乳糖(Gal)为非还原末端,其中以Glc为主,而Rha仅以非还原末端形式存在于糖链中;主链以(1→2)与(1→4)-连接的半乳糖醛酸(Gal A)和(1→4)-连接的Glc构成,其中主要为(1→4)-连接的Glc,同时存在少量分支结构,即(1→3,4)、(1→4,6)与(1→3,6)-连接的甘露糖。-消除反应测定结果表明,人参糖蛋白含有O-糖肽键,且N-乙酰氨基半乳糖胺(Gal NAc)是通过(1→4)-连接与氨基酸成键;蛋白部分由17种氨基酸组成。人参糖蛋白腹腔注射20mg/kg时,可显著降低小鼠自主活动次数(P<0.05);可显著减少阈下剂量戊巴比妥钠所致小鼠的睡眠潜伏期,并延长睡眠时间(P<0.05)。人参糖蛋白具有镇静安眠的作用。

人参糖蛋白降低Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞凋亡中一氧化氮释放的保护作用

目的确定人参糖蛋白的基本化学构成,探讨人参糖蛋白抗β-淀粉样蛋白(Aβ25-35)引起的神经炎症和神经保护作用。方法采用超滤、葡聚糖凝胶等方法分离纯化得到人参糖蛋白(Pg Gp),采用苯酚-硫酸法测定总糖含量,Lowry法测定蛋白含量,高效液相色谱法测定纯度和分子量分布。利用MTT法考察Pg Gp(5,25,125μg/m L)对细胞存活率的影响;Griess法测定Pg Gp对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞一氧化氮释放的影响。结果Pg Gp总糖含量为25.9%,蛋白含量为73.4%,分子量分布在200~50 000 Da。Pg Gp在不影响细胞存活率情况下,中、高剂量组与模型组比较,表现出保护Aβ25-35诱导的SH-SY5Y释放NO的能力(P<0.05,P<0.01)。结论人参糖蛋白可降低Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞一氧化氮释放量,从而具有保护神经细胞的作用。

正交试验优选人参水溶性糖蛋白提取工艺研究

目的：通过正交试验优选人参水溶性糖蛋白提取工艺,为人参糖蛋白的分离纯化及性质研究奠定基础。方法：利用正交试验设计,采用缓冲溶液提取得到人参水提取物,以蛋白收率和糖收率为评价指标,测定各水提物中的糖蛋白含量,确立人参糖蛋白最佳提取方法。结果：共得到16个样品,其中4号样品提取物收率、蛋白收率及糖收率均最高;对16个样品进行聚类分析,根据聚类分析和正交实验直观分析结果,最终确立人参水溶性糖蛋白的提取工艺为：pH 6.0,料液比1∶10,提取时间6 h,提取温度60℃,提取次数2次。结论：该研究优化得到人参水溶性糖蛋白的最佳提取工艺,可为人参糖蛋白的进一步研究提供基础和依据。

人参糖蛋白肠溶微丸的制备及其镇痛作用研究

目的:制备人参糖蛋白肠溶微丸并观察其镇痛作用。方法:采用离心式制丸机将人参糖蛋白制备成肠溶微丸;分别测定此微丸在人工胃液与人工肠液中1 h的溶解特性;通过小鼠醋酸扭体实验,观察微丸的镇痛作用。结果:微丸在人工胃液中溶解度较低,在人工肠液中溶解度较高。微丸在口服给药剂量为400 mg/kg,口服给药2 h后达到最佳镇痛效果。结论:人参糖蛋白肠溶微丸达到了在人工胃液中少溶,在人工肠液中大部分溶解的预期效果,且口服后具有较好的镇痛作用。

人参糖蛋白对少弱精症小鼠生精障碍的改善作用

目的:探讨人参糖蛋白(PGG)对少弱精症小鼠生精障碍的改善作用,并初步阐明其作用机制。方法:选取健康雄性小鼠60只,随机分成正常组、模型组、阳性对照组(生精胶囊,700 mg·kg^(-1))、低剂量PGG组(100 mg·kg^(-1) PGG)、中剂量PGG组(200 mg·kg^(-1) PGG)和高剂量PGG组(400 mg·kg^(-1) PGG),每组10只。除正常组外,其余组小鼠腹腔注射30 mg·kg^(-1)环磷酰胺,制备少弱精症模型。取各组小鼠附睾采集精子,显微镜下观察精子总数、精子活率、精子畸形率和精子活力,观察各组小鼠精子形态,采集各组小鼠睾丸(双)、前列腺+贮精囊(双)、包皮腺(双)和提肛肌,称质量并计算脏器系数,苏木精-伊红(HE)染色观察各组小鼠睾丸组织病理形态表现,ELISA法测定各组小鼠血清睾酮(T)、卵泡刺激素(FSH)和催乳素(PRL)水平。结果:与正常组比较,模型组小鼠精子总数降低(P<0.01)、精子活率降低(P<0.01)、精子畸形率升高(P<0.01)、精子活力降低(P<0.01),睾丸和前列腺+贮精囊脏器系数降低(P<0.05或P<0.01),包皮腺和提肛肌脏器系数差异无统计学意义(P>0.05),生精小管中生精细胞层厚度和生精细胞层横截面面积减小(P<0.01),血清T、FSH和PRL水平降低(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,中和高剂量PGG组小鼠精子总数升高(P<0.05)、精子活率升高(P<0.01)、精子畸形率降低(P<0.05或P<0.01)、精子活力升高(P<0.05或P<0.01),各脏器系数差异无统计学意义(P>0.05),生精小管中生精细胞层厚度和生精细胞层横截面面积增大(P<0.05或P<0.01),生精胶囊组、中和高剂量PGG组小鼠血清T水平升高(P<0.05或P<0.01)、生精胶囊组和各剂量PGG组小鼠血清FSH水平升高(P<0.05或P<0.01),各剂量PGG组小鼠血清PRL水平升高(P<0.01)。结论:PGG具有剂量依赖性,给药剂量增加药效增强,PGG能明显改善少弱精症小鼠生精障碍,其机制可能与PGG提高小鼠血清性激素水平有关。

人参糖蛋白的分离纯化及其性质研究

目的:分离纯化人参糖蛋白组分 LRC 并研究其理化性质及初步的结构特性。方法:采用 HiPrep 2660 Sephacryl S200和Hitrap Q^(TM) 26/60柱色谱得到均一的糖蛋白组分,高压柱层析法、凝胶电泳法及3种分离原理的毛细管电泳法检测纯度,薄层色谱和气相色谱分析单糖组成,红外光谱确定糖苷键类型。结果:LRC 为均一组分,单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖,其摩尔比为1.00:3.45:0.612:5.03,总糖含量为32%,蛋白含量为60%,由门冬氨酸、谷氨酸等17种氨基酸组成,糖肽键为苏氨酸连接的 O-型糖肽键。结论:LRC 是以α-吡喃糖为主的糖蛋白,相对分子质量为2.4×10~4。

响应面法优化人参糖蛋白制备工艺

目的:优化人参糖蛋白的制备工艺。方法:利用Box-Behnken响应面法分析提取时间、提取次数、料液比、乙醇体积分数对人参糖蛋白的影响。结果:最优人参糖蛋白制备工艺为提取时间1.5 h、提取次数3次、料液比(m_(人参粗粉)∶V_(蒸馏水))1.0∶15.4(g/mL)、乙醇体积分数72%,该条件下人参糖蛋白质量分数为24.14%。结论:优化的人参糖蛋白的制备工艺稳定性好、准确可靠、提取率高,具有一定的实用价值。

人参非皂苷成分中具有治疗老年痴呆作用的活性成分筛选及其结构表征

目的在人参非皂苷成分中筛选出对Aβ25-35诱导所致痴呆大鼠模型的学习记忆功能有改善作用的活性成分,并对其进行结构研究。方法建立大鼠老年痴呆模型,通过水迷宫实验,理化性质研究,纯度与分子量测定筛选活性成分。再对此活性成分通过组成糖分析、糖苷键连接方式的测定与氨基酸分析对其进行结构研究。结果水迷宫实验筛选出的活性成分为JJPG-3,理化性质研究结果显示其蛋白含量最高,纯度与分子量测定结果表明其为混合物,分子量在200Da^50000Da之间,综合上述实验结果,判定其活性成分为人参糖蛋白。在对此人参糖蛋白进行组成糖分析,糖苷键连接方式分析与氨基酸测定,结果显示,该活性成分由7种糖组成,以Glc含量最高;主链由(1→4)连接的Gal A和(1→6)连接的Man组成,非还原末端由Rha、Man、Glc、Gal A组成,以Glc居多;该糖蛋白由17种氨基酸组成,其中Arg、Gly和Glu含量最高。结论人参非皂苷成分中具有治疗老年痴呆作用的成分为人参糖蛋白,对该活性成分进行结构分析,测定其由7种糖与17种氨基酸组成,糖苷键连接方式同上所述。该文章为人参非皂苷成分的研究奠定基础的同时也为治疗老年痴呆症的药物提供新的研究方向。

人参糖蛋白对阿霉素所致心肌毒性的保护作用及其机制研究

目的通过体内外实验,探讨人参糖蛋白对阿霉素心脏毒性的保护作用及机制。方法建立SD大鼠心肌损伤模型,给予人参糖蛋白进行干预后,检测血清中乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)、肌酸激酶同工酶MB(creatinekinase isoenzymes-MB,CK-MB)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平;采用苏木素-伊红(HE)染色法观察大鼠心肌组织病理变化。建立心肌细胞H9c2损伤模型,采用CCK-8法检测H9c2细胞活力;通过流式细胞术检测H9c2细胞周期、细胞凋亡、活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平和线粒体膜电位变化;采用Western blotting法检测H9c2细胞凋亡相关蛋白、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路相关蛋白、沉默信息调节因子2相关酶类3(silent mating type information regulation 2 homolog 3,Sirt3)的表达情况。结果心肌损伤大鼠模型中,模型组大鼠心肌纤维排列紊乱,肌纤维严重变性,LDH和CK-MB活性显著升高(P<0.01),SOD活性和GSH水平显著降低(P<0.05、0.01);与模型组比较,人参糖蛋白高剂量组心肌肌束排列较为整齐,LDH和CK-MB活性显著下降(P<0.05),GSH水平显著升高(P<0.05),人参糖蛋白对阿霉素所致的心肌组织病理学损伤有明显修复作用。细胞损伤模型中,模型组细胞存活率显著下降(P<0.001),细胞周期阻滞于G1期(P<0.01),细胞凋亡显著升高(P<0.01),ROS水平显著升高(P<0.01),线粒体膜电位显著下降(P<0.01),Sirt3、Caspase-3、B淋巴细胞瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白表达水平显著降低(P<0.01),Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、细胞色素C(cytochrome C,Cyt C)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38、细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)蛋白表达水平显著升高(P<0.05、0.01);与模型组比较,人参糖蛋白组细胞存活率显著升高(P<0.05、0.01),细胞增殖周期恢复,细胞凋亡率显著降低(P<0.05),ROS水平显著降低(P<0.05),线粒体膜电位显著升高(P<0.05),Sirt3、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05),Bax、Cyt C、JNK、p38、ERK1/2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论人参糖蛋白能够通过抗氧化应激、降低线粒体膜电位、提高H9c2细胞内ROS水平并调控MAPK信号通路抑制细胞凋亡,从而保护阿霉素诱导的心肌损伤。

人参糖蛋白对小鼠行为学和海马内单胺类神经递质的影响

试验研究了人参糖蛋白(Glycoprotein from Panax ginseng,PGG)对行为绝望模型小鼠海马内单胺类神经递质的影响。将50只小鼠(昆明种)随机分为5组,采用悬尾试验和强迫游泳试验考察PGG对绝望模型小鼠行为学的影响;利血平诱导试验考察PGG对小鼠体温和眼睑的影响;采用高效液相色谱仪结合电化学检测其考察PGG对小鼠海马内5-羟色胺(5-hydroxy tryptamine,5-HT)和5-羟吲哚乙酸(5-hydroxyindole acetic acid,5-HIAA)含量的影响。试验结果表明:与生理盐水组相比,PGG中、高剂量可以明显减少悬尾和强迫游泳的不动时间(P<0.01),逆转利血平诱导的体温降低和眼睑下垂(P<0.05),并提高海马内5-HT及其代谢产物的水平(P<0.05)。这说明PGG对行为绝望模型小鼠具有保护作用,可能是通过升高海马内单胺类递质的含量实现的。