沙眼衣原体GlgA蛋白表达和分泌的调控机制

【背景】沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)的分泌蛋白在Ct与宿主细胞的相互作用、感染发育周期及致病过程中发挥着至关重要的作用。GlgA蛋白是课题组前期研究发现的一种新的Ct分泌蛋白,其表达和分泌的具体机制及作用还不清楚。【目的】寻找调控CtGlgA蛋白表达和分泌的分子机制,为后续Ct致病机制研究提供实验基础和新思路。【方法】采用Signal P 4.1软件对GlgA蛋白N端进行信号肽预测分析,并用细菌分泌蛋白特异性阻断剂C16和C1化合物分别或同时处理Ct感染的He La细胞,观察阻断Ⅱ型、Ⅲ型分泌途径对GlgA蛋白分泌的影响;经新生霉素处理、噬斑筛选及穿梭质粒转染技术,构建Ct质粒缺失株和缺失互补株,并鉴定质粒编码基因在两种菌株的缺失及表达情况;间接免疫荧光法观察质粒缺失对GlgA表达和分泌的影响。【结果】GlgA蛋白N端无信号肽序列,细菌Ⅱ型、Ⅲ型分泌途径特异性阻断剂C16和C1化合物不能阻断GlgA的胞浆分泌;Ct质粒缺失株CTD1的质粒编码基因pgp7丢失,且质粒编码蛋白Pgp3及基因组编码蛋白GlgA的表达和分泌现象均消失;Ct缺失互补株CTD1-pGFP::SW2重新获得pgp7基因,并恢复Pgp3蛋白和GlgA的表达和分泌。【结论】初步证实Ct糖原合酶GlgA蛋白的表达和分泌不依赖细菌Ⅱ型和Ⅲ型分泌途径,而且与衣原体质粒密切相关。

沙眼衣原体质粒调控基因的上游序列有广泛的ChxR结合位点

目的:利用凝胶阻滞实验分析沙眼衣原体质粒调控基因的上游DNA序列与ChxR 的相互作用;方法:利用表达载体p ET-21b在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达ChxR ,重组蛋白的N端有T7标签、C端有6×His标签,用TALON金属亲和介质纯化重组蛋白;PCR扩增沙眼衣原体质粒调控基因的上游区约150 bp,连接p CR2.1载体,重组载体经单酶切,制备3'端生物素标记探针;用引物延伸实验确定glgA的转录起始位点,并合成5条glgA上游区的30 bp重叠探针;用凝胶阻滞实验分析ChxR 与以上探针的相互作用。结果:4个质粒调控基因的上游均有多个ChxR 结合位点,特别是glgA上游区至少有6个结合位点;glgA上游的ChxR 结合位点多位于启动子和启动子下游区。结论:ChxR 可能参与质粒调控基因的转录;在glgA转录中,ChxR 可能起转录抑制子的作用。