柚皮素激活SHH-GLI1信号通路对OGD/R诱导的神经元损伤的影响

目的探究柚皮素(NAR)对氧糖剥夺/复氧复糖(OGD/R)诱导神经元损伤的改善作用及机制。方法将大鼠皮层神经元分为正常组、OGD/R组、NAR组和NAR+环巴胺组,给予相应处理。CCK-8法测定神经元活性;试剂盒测定神经元活性氧(ROS)、8-羟脱氧鸟苷(OHdG)、丙二醛(MDA)水平;TUNEL染色观察神经元凋亡;Western印迹检测声波刺猬(SHH)-胶质瘤相关癌基因同源物(GLI)1通路及脑源性神经营养因子(BDNF)、c-AMP反应元件结合蛋白(CREB)水平;免疫荧光染色观察GLI1的核移位。结果CCK-8法分析显示,40 mg/L NAR为最佳作用浓度。相较于正常组,OGD/R组神经元ROS相对荧光强度、8-OHdG、MDA水平、TUNEL+神经元数量、SHH、GLI1、Ptch1、BDNF、CREB蛋白及核/质GLI1水平明显增加(P<0.05);相较于OGD/R组,NAR组神经元ROS相对荧光强度、8-OHdG、MDA水平、TUNEL+神经元数量明显降低(P<0.05),SHH、GLI1、Ptch1、BDNF、CREB蛋白及核/质GLI1水平明显增加(P<0.05);相较于NAR组,NAR+环巴胺组神经元ROS相对荧光强度、8-OHdG、MDA水平、TUNEL+神经元数量明显增加(P<0.05),BDNF、CREB蛋白及核/质GLI1水平明显降低(P<0.05),SHH、GLI1、Ptch1蛋白无明显变化(P>0.05)。结论NAR可以减轻OGD/R诱导的神经元氧化损伤,其作用机制与激活SHH-GLI1通路有关。

水苏碱调节Shh/Gli1信号通路对口腔癌细胞迁移、侵袭和上皮间质转化的影响

目的探讨水苏碱(Sta)调节超音速刺猬因子(Shh)/胶质瘤相关癌基因同源物1(Gli1)信号通路对口腔癌(OC)细胞迁移、侵袭和上皮间质转化(EMT)的影响。方法采用蛋白质印迹技术检测Shh、Gli1在正常口腔上皮角质细胞HOK和OC细胞株系(Cal-27、Tca8113、SCC-9、HSC-3)中的表达,选择其中高表达的HSC-3细胞为研究对象,随机分为Control组、L-Sta组、M-Sta组、H-Sta组、PM组。EdU染色检测HSC-3细胞增殖;划痕实验检测HSC-3细胞的迁移;Transwell实验检测HSC-3细胞侵袭;采用蛋白质印迹技术检测Sta对E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Shh、Gli1蛋白表达的影响;小鼠荷瘤实验验证Sta对OC肿瘤生长和OC组织Shh、Gli1蛋白表达的影响。结果L-Sta组、M-Sta组、H-Sta组HSC-3细胞EdU阳性细胞率、划痕愈合率、侵袭数、N-cadherin、Vimentin、Shh、Gli1表达低于Control组,E-cadherin表达高于Control组(P<0.05);与H-Sta组相比,PM组EdU阳性细胞率、划痕愈合率、侵袭数、N-cadherin、Vimentin、Shh、Gli1表达升高,E-cadherin表达降低(P<0.05)。Sta组移植瘤质量、体积、Shh阳性率、Gli1阳性率低于对照组(P<0.05)。结论Sta可以抑制OC细胞迁移、侵袭和EMT,其机制可能是通过调节Shh/Gli1信号通路实现的。

缺氧对宫颈癌SiHa细胞中Gli1与Sox2表达的影响

目的:分析胶质瘤相关癌基因同源物1(Gli1)和性别决定区Y框蛋白2(Sox2)在宫颈癌细胞中的表达及其病理学意义,探讨Gli1与宫颈癌干性特征的相关性。方法:采用免疫组织化学染色方法检测159例宫颈癌组织中Gli1、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、Sox2、性别决定区Y框蛋白9(Sox9)、分化簇44(CD44)、八聚体结合转录因子4(OCT4)和赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)的表达并分析其相关性;使用基因表达谱数据动态分析(GEPIA)明确Gli1对宫颈癌状细胞患者预后的影响及其与干细胞标志物的相关性;缺氧条件下检测SiHa细胞的球体形成能力及其干细胞标志物表达。结果:免疫组织化学染色,在宫颈癌组织中Gli1表达率与HIF-1α(r=0.374,P<0.001)和Sox2表达水平(r=0.176,P<0.05)呈正相关关系;GEPIA数据库分析,宫颈癌中Gli1阳性表达的患者预后差(P<0.05)。缺氧条件下SiHa细胞中Gli1、HIF-1α和Sox2的mRNA及蛋白表达水平均明显升高(P<0.001),且具有较强的球体形成能力。结论:缺氧上调宫颈癌细胞Gli1和Sox2 mRNA及蛋白表达水平,促进癌细胞的干性特征形成。

针灸预处理对胃溃疡大鼠胃黏膜状态及Gli 1/Gli 2/Sufu信号通路的影响研究

目的:研究针灸预处理对胃溃疡大鼠胃黏膜状态及胶质瘤相关癌基因同源物1(Glioma-associated oncogene homolog 1,Gli1)/胶质瘤相关癌基因同源物2(Glioma-associated oncogene homolog 2,Gli2)/丝氨酸/苏氨酸激酶Fused抑制物(Sufu)信号通路的影响,探究针灸预防胃黏膜损伤的作用机制,为针灸在临床治疗胃溃疡疾病提供实验依据和理论支撑。方法:52只大鼠随机分为正常组、模型组、灸预处理组、针刺预处理组,每组13只。正常组、模型组只做固定;对灸预处理组和针刺预处理组艾灸中脘、足三里穴,每穴20min,1次/d,连续灸8d。之后对灸预处理组和针刺预处理组大鼠进行无水乙醇+阿司匹林混悬液灌胃造模。观察大鼠一般情况及胃黏膜组织病理学变化;酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)浓度,蛋白质印迹法(Western blot)分析大鼠胃黏膜组织Gli 1、Gli 2、Sufu蛋白表达。结果:模型组可见上皮细胞结构破坏不完整,胃黏膜组织损伤明显,UI指数评分显著高于正常组(P<0.05)。与正常组比较,模型组大鼠血清MDA、GPX浓度升高(P<0.05),SOD浓度降低(P<0.05);与模型组相比,针灸预处理组MDA、GPX浓度降低(P<0.05),SOD浓度增加(P<0.05);与正常组比较,模型组大鼠Gli1、Gli2、Sufu蛋白表达明显升高(P<0.05);与模型组比较,针灸预处理组大鼠Gli1、Gli2、Sufu蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论:针灸预处理能改变胃溃疡大鼠胃黏膜状态,其机制可能与Gli 1/Gli 2/Sufu信号通路活化有关。

Pdx-1、Ngn3联合MafA诱导干细胞分化为胰岛素分泌细胞移植治疗1型糖尿病大鼠的效果

目的通过胰十二指肠同源盒1(Pdx-1)、神经元素3(Ngn3)联合V型肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源基因A(MafA)共转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导分化为胰岛素分泌细胞(IPCs),移植治疗1型糖尿病大鼠并观察其疗效。方法Pdx-1、Ngn3和MafA共转染BMSCs诱导为IPCs,链脲佐菌素(STZ)制备45只1型糖尿病SD大鼠模型,BMSCs组(15只)肾被膜下移植2×10^(6) BMSCs,IPCs组(15只)大鼠肾被膜下移植2×10^(6) IPCs,sham-operation组(15只)大鼠肾被膜下注入等量生理盐水,另取15只健康SD大鼠肾被膜下注入等量生理盐水作为normal组。监测各组大鼠移植第0、7、14、21、28 d空腹血糖及体重;第21天对各组大鼠均行葡萄糖耐量试验;第28天取各组大鼠肾脏组织进行免疫组化。结果BMSCs和IPCs组大鼠血糖随时间下降,移植第21天两组大鼠空腹血糖低于移植第0天,且均低于同期sham-operation组(P<0.05),移植第28天IPCs组大鼠空腹血糖低于BMSCs组(P<0.05)。糖尿病大鼠中IPCs组和BMSCs组腹腔葡萄糖耐量实验曲线下面积小于sham-operation组,且IPCs组曲线下面积最小(P<0.05)。BMSCs组和IPCs组大鼠肾脏组织可见棕色荧光的胰岛素表达,且IPCs组胰岛素荧光光密度高于BMSCs组(P<0.05)。结论Pdx-1-Ngn3联合MafA诱导BMSCs形成的IPCs移植后在糖尿病大鼠体内可降低糖尿病大鼠的空腹血糖。

瑞香素调节Shh/Gli1信号通路对乳腺癌增殖、凋亡和化疗敏感性的影响

目的探究瑞香素调节音猬因子(Shh)/胶质细胞瘤转录因子1(Gli1)信号通路对乳腺癌增殖、凋亡和化疗敏感性的影响。方法将人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞分为对照组、瑞香素组(40μmol/L瑞香素)、GANT61组(10μmol/L GANT61)、瑞香素+GANT61组(40μmol/L瑞香素和10μmol/L GANT61);CCK-8实验检测MDA-MB-231细胞增殖;划痕试验检测MDA-MB-231细胞迁移情况;在上述各分组细胞中加入1 mg/L阿霉素(Dox)处理48 h后CCK-8实验检测细胞化疗敏感性;流式细胞术检测MDA-MB-231细胞凋亡情况;Western blot检测MDA-MB-231细胞Shh/Gli1通路及凋亡相关蛋白表达水平。结果与0μmol/L比较,随着瑞香素的剂量增加MDA-MB-231细胞存活率显著降低(P<0.05),而与40μmol/L比较,50μmol/L瑞香素处理MDA-MB-231细胞存活率无差异(P>0.05),因此选择40μmol/L瑞香素作为后续实验的干预条件;与对照组比较,瑞香素组和GANT61组OD450值、划痕愈合率以及Gli1、Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05),Bax蛋白表达、细胞凋亡率和Dox化疗敏感性显著升高(P<0.05);与瑞香素组比较,瑞香素+GANT61组OD450值、划痕愈合率以及Gli1、Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05),Bax蛋白表达、细胞凋亡率和Dox化疗敏感性显著升高(P<0.05)。结论瑞香素可能通过抑制Shh/Gli1信号通路来抑制乳腺癌细胞增殖,诱导细胞凋亡以及提高化疗敏感性。

布托啡诺通过下调布托啡诺调节音猬因子/胶质瘤相关癌基因同源物1通路抑制胶质瘤细胞恶性生物学行为

目的探讨布托啡诺调节音猬因子(SHH)/胶质瘤相关癌基因同源物1(GLI1)信号通路对胶质瘤细胞恶性生物学行为的影响。方法将胶质瘤LN229细胞分为对照组、布托啡诺低剂量组、布托啡诺中剂量组、布托啡诺高剂量组以及布托啡诺高剂量+pc DNA3.1组、布托啡诺高剂量+pc-SHH组。MTT和Edu实验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡率;Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测SHH mRNA、GLI1 mRNA表达水平;蛋白免疫印迹(Western blot)检测Ki-67、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、裂解的半胱天冬酶-3(Cleaved-Caspase-3)、SHH和GLI1蛋白表达水平。结果布托啡诺可降低LN229细胞活力、增殖率,减少细胞迁移和侵袭个数(P<0.05)。布托啡诺可降低LN229细胞中SHH mRNA、GLI1 mRNA表达水平及Ki-67、MMP-2、SHH和GLI1蛋白表达,促进细胞凋亡和增高Cleaved-Caspase-3蛋白表达(P<0.05)。过表达SHH可部分逆转布托啡诺对LN229细胞的抑制作用(P<0.05)。结论布托啡诺可以抑制胶质瘤细胞的恶性生物学行为,其机制可能与抑制SHH/GLI1信号通路有关。

党参炔苷调节Shh/Gli1信号通路对胃癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化的影响

目的:探讨党参炔苷(LOB)调节音猬因子(Shh)/胶质细胞瘤转录因子1(Gli1)信号通路对胃癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化(EMT)的影响。方法:体外培养MKN-45细胞,分为对照组、LOB组(10μmol/L LOB)、SHH特异性激活剂组(PM组,1μmol/L PM)、LOB+PM组(10μmol/L LOB+1μmol/L PM);CCK-8实验检测MKN-45细胞增殖;划痕试验检测MKN-45细胞迁移;Transwell检测MKN-45细胞侵袭;流式细胞术检测MKN-45细胞凋亡;Western blot检测EMT相关蛋白和Shh、Gli1蛋白表达水平。结果:相较于对照组,LOB组吸光度(A_(450))值、划痕愈合率、细胞侵袭数目及Vimentin、Gli1、Shh、N-cadherin蛋白表达下降(P<0.05),细胞凋亡率和E-cadherin蛋白表达显著升高(P<0.05);PM组A_(450)值、划痕愈合率、细胞侵袭数目及Vimentin、Gli1、Shh、N-cadherin蛋白表达增高(P<0.05),细胞凋亡率和E-cadherin蛋白表达显著降低(P<0.05);与LOB组相比,LOB+PM组A_(450)值、划痕愈合率、细胞侵袭数目及Vimentin、Gli1、Shh、N-cadherin蛋白表达增高(P<0.05),细胞凋亡率和E-cadherin蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论:LOB可诱导MKN-45细胞凋亡,抑制增殖和EMT,这可能与调节Shh/Gli1信号通路有关。

左、右半结肠癌PD-L1表达、MSI状态、KRAS突变及临床病理特征的差异

目的:探讨左半结肠癌、右半结肠癌程序性死亡因子配体1(programmed death-ligand 1,PD-L1)表达、微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog,KRAS)基因突变以及临床病理特征的差异。方法:收集2021年1月至12月郑州大学附属肿瘤医院临床病理中心723例结直肠癌患者的临床病理与分子检测资料进行回顾性分析;采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)法检测MSI、KRAS基因突变,免疫组织化学法评估PD-L1蛋白表达。结果:在723例结直肠癌中,左半结肠癌521例,右半结肠癌202例。相较于左半结肠癌,右半结肠癌具有女性多发、浸润深度更深、分化更差的特点(均P<0.05);同时,右半结肠癌MSI发生率显著高于左半结肠癌(P<0.001),且PD-L1的联合阳性分数也显著高于左半结肠癌(P=0.022)。此外,左、右半结肠癌在年龄、淋巴转移、脉管癌栓、神经侵犯和KRAS基因突变等方面差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论:左半结肠癌、右半结肠癌的临床病理特征、MSI状态及PD-L1表达均存在显著差异,提示左、右半结肠癌可能是两种不同的肿瘤。

西藏地区结直肠癌免疫治疗和靶向治疗相关分子标志物的检测及意义

目的研究西藏地区结直肠癌中SWI/SNF相关、基质相关、肌动蛋白依赖性染色质调节因子A亚科成员4(SMARCA4)/Brahma相关基因1、V-raf鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B(BRAF)、P53、程序性死亡受体1(PD-1)及程序性死亡配体1(PD-L1)免疫组织化学表达和BRAF、神经营养因子酪氨酸受体激酶(NTRK)基因改变情况,为西藏地区结直肠癌患者的靶向治疗及免疫治疗提供依据。方法收集2015年1月至2021年7月西藏自治区人民医院经手术切除病理确诊为结直肠癌病例64例,全部病例均进行SMARCA4、BRAF、P53、PD-1、PD-L1免疫组织化学染色和NTRK1、NTRK2、NTRK3融合基因荧光原位杂交检测及BRAF V600E基因突变PCR检测。结果64例结直肠癌病例男女比例1.21∶1,平均年龄(56.59±13.27)岁;46例(71.88%)位于结肠,18例(28.12%)位于直肠;60例(93.75%)为腺癌,4例(6.25%)为其他类型;11例(17.19%)为T1或T2期,53例(82.81%)为T3或T4期;24例(37.50%)出现淋巴结转移。免疫组织化学方面,64例中1例(1.56%)SMARCA4部分肿瘤细胞表达减弱或缺失,4例(6.25%)BRAF肿瘤细胞阳性表达,35例(54.69%)P53为突变型表达;45例(70.31%)PD-1肿瘤相关免疫细胞阳性比例分数<10%,19例(29.69%)≥10%;52例(81.25%)PD-L1联合阳性分数<10,12例(18.75%)≥10。64例NTRK1、NTRK2、NTRK3融合基因检测均为阴性;4例(6.25%)检测到BRAF V600E基因突变;1例SMARCA4表达缺失病例未检测到SMARCA4基因改变。PD-L1的表达与错配修复缺陷/高度微卫星不稳定和PD-1的高表达呈显著正相关(χ^(2)=10.223,P=0.001;χ^(2)=11.979,P=0.001)。结论西藏地区结直肠癌中较少出现SMARCA4表达减弱或缺失及NTRK融合基因改变,少数病例有BRAF V600E基因突变,Pan-TRK和BRAF免疫组织化学可作为NTRK融合基因及BRAF基因突变的初筛方法。错配修复缺陷/高度微卫星不稳定的病例中更容易出现PD-L1蛋白高表达,这部分患者有望获益于免疫治疗。P53突变与PD-L1表达无相关性,PD-1的高表达和PD-L1的高表达呈正相关。

SHH和GLI1在早期宫颈癌组织中的表达及意义

目的探讨SHH及神经胶质瘤相关基因同源蛋白1(GLI1)在宫颈癌前病变、早期宫颈癌组织中的表达及意义。方法选取早期宫颈癌患者36例、CINⅢ级28例、正常宫颈20例,使用免疫组化S-P法检测上述组织标本中SHH及GLI1的表达。结果 SHH蛋白阳性表达率分别为正常宫颈组织20.0%(4/20)、宫颈CINⅢ60.7%(17/28)、早期宫颈癌69.4%(25/36),两两比较差异有统计学意义(P均<0.05)。GLI1蛋白阳性表达率分别为正常宫颈组织25.0%(5/20)、宫颈CINⅢ53.6%(15/28)、早期宫颈癌58.3%(21/36),两两比较差异有统计学意义(P均<0.05)。结论 SHH、GLI1过度表达可能参与了宫颈癌的发生发展,其检测有助于宫颈癌的早期诊断。

超音刺猬蛋白 转录因子叉头框转录因子M1及神经胶质瘤相关癌基因同源物1在宫颈癌中的表达与临床意义

目的探究刺猬因子(Hedgehog)信号通路分子超音速刺猬蛋白(Shh)及其下游转录因子叉头框转录因子M1(FoxM1)和神经胶质瘤相关癌基因同源物1(Gli1)在宫颈癌中的表达水平及其与临床病理特征的关系。方法选取遂宁市中心医院2016年1月至2016年8月收治的50例宫颈癌患者宫颈黏膜组织作为观察组,选取30例同期收入的宫颈黏膜组织正常的阴道炎患者作为对照组,应用免疫组化检测两组对象宫颈黏膜组织中Shh、FoxM1、Gli1的表达情况,分析宫颈癌组织中Shh、FoxM1、Gli1蛋白表达与临床病理特征之间的关系。结果 Shh、FoxM1、Gli1蛋白在宫颈癌组织中的表达阳性率分别为86%、90%、92%,较正常宫颈组织升高,差异有统计学意义(P<0.05);Shh、FoxM1、Gli1蛋白与患者年龄、肿瘤大小、浸润深度均无显著相关性(P>0.05);Spearman相关性分析显示,Shh在宫颈癌中的表达与组织分化程度、FIGO分期、淋巴结转移相关(P<0.05);FoxM1只与淋巴结转移相关(P<0.05);Gli1的表达水平与宫颈癌组织的分化程度、淋巴结转移相关(P<0.05);Shh、FoxM1、Gli1三者之间互为正相关(P<0.05)。结论 Shh、FoxM1、Gli1在宫颈癌组织中呈高表达状态,Shh和Gli1蛋白与宫颈癌组织分化程度有关,而FoxM1蛋白只与宫颈癌是否发生淋巴结转移有关,此三者的检测,有助于宫颈癌的早期诊断,可作为预测宫颈癌发生发展的指标。

^(252)锎中子射线对宫颈癌组织中VEGF和Gli-1表达的影响

目的探讨252锎(252Cf)中子射线对宫颈癌组织中胶质瘤相关癌基因蛋白1(Gli-1)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法选取25例接受252Cf中子腔内放疗联合体外照射的宫颈癌患者的宫颈癌组织,采用免疫组化SP法和免疫印迹法分别检测放疗前后宫颈癌组织中VEGF和Gli-1的表达情况,并分析不同病理参数下放疗前后的VEGF阳性细胞率和Gli-1相对光密度,同时选取5例宫颈炎症组织作对照。结果宫颈癌组织放疗前的VEGF高表达率和Gli-1相对光密度分别为80.0%和0.80±1.73,高于放疗后的44.0%和0.41±0.65及宫颈炎症组织的20.0%和0.20±0.50,差异有统计学意义(P<0.05);不同分期和分化水平宫颈癌组织放疗后的VEGF阳性细胞率、Gli-1相对光密度均低于放疗前(P<0.05)。结论 252Cf中子射线腔内照射可以降低宫颈癌组织中VEGF和Gli-1的表达水平。

转化生长因子β1诱导心肌成纤维细胞转分化过程中Hedgehog信号通路的作用机制

背景:近年来越来越多的研究表明Hedghog信号通路异常活化广泛参与全身多组织器官疾病的损伤修复过程,但其在心肌纤维化中的相关作用尚不明确。目的:研究阻断Hedgehog-Gli信号通路对转化生长因子β1诱导的心肌成纤维细胞上皮间质转分化过程的影响。方法:①动物实验:左冠状动脉结扎法建立小鼠心肌梗死模型,苏木精-伊红和Masson染色法观察梗死后3,7,14 d心肌组织的病理改变,用RT-PCR、Western blot和免疫荧光法检测不同时段Gli1 mRNA及蛋白的时空表达,RT-PCR和免疫荧光定量检测加入特异性阻断剂后Gli1的mRNA及蛋白的时空表达变化。②细胞实验:差速贴壁法原代培养SD乳鼠心肌成纤维细胞,采用不同质量浓度(0,1,5,10μg/L)转化生长因子β1刺激心肌成纤维细胞,RT-PCR、Western blot检测Gli1 mRNA及蛋白表达,选用10μg/L的转化生长因子β1诱导心肌成纤维细胞24 h,免疫荧光法检测Gli1蛋白时空表达及上皮间质转分化标记物的表达。分别采用GANT61和Cyclopamine特异性阻断Hedgehog信号通路中的Gli1和Smo 24 h后,加入10μg/L转化生长因子β1,RT-PCR检测Gli1 mRNA表达变化,荧光免疫法检测Gli1的时空表达以及上皮间质转分化标记物的表达变化。结果与结论:①动物实验结果:随着梗死后时间延长,小鼠心肌Gli1的mRNA和蛋白表达水平逐渐升高,而加入Hedgehog通路特异性阻断剂后梗死组织中Gli1的mRNA及蛋白表达均有下降。②细胞实验结果:采用转化生长因子β1刺激后,心肌成纤维细胞上皮间质转化为肌成纤维细胞(特异性标记物a-SMA阳性);随着转化生长因子β1干预剂量增加,Gli1的mRNA及蛋白表达逐渐增加。采用阻断剂特异性阻断Hedgehog信号通路中的Gli1和Smo 24 h后,Gli1的mRNA和蛋白表达均受抑制,同时伴有上皮间质转化发生的生物标记物E-Cadherin和Vimentin的表达改变,证实发生了上皮间质转化。③结合体内及体外实验,共同证实了Hedgehog-Gli信号通路参与心肌纤维化及心肌成纤维细胞转分化发生发展过程。

Gli通过PLK1对食管腺癌细胞肿瘤生物学行为影响的研究

目的观察胶质瘤相关癌基因同源物(glioma-associated oncogene homolog,Gli)通过Polo样激酶1(Polo-like kinase 1,PLK1)对食管腺癌肿瘤生物学行为的影响并探讨其相关的分子机制。方法应用二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、GANT61、N-Shh蛋白及GANT61&N-Shh分别处理食管腺癌OE33细胞株24 h后,实时荧光定量PCR法和Western blot法观察Gli1、Gli2和PLK1的表达;GANT61处理细胞48 h后观察对Gli1、Gli2、PLK1蛋白表达的影响,流式细胞术观察GANT61处理细胞72 h后对细胞周期和凋亡的影响。结果 GANT61组在Gli1 mRNA和Gli1蛋白、Gli2 mRNA和Gli1蛋白以及PLK1 mRNA和Gli1蛋白的表达明显低于DMSO组,N-Shh组明显高于DMSO组和GANT61组,GANT61+N-Shh组低于DMSO组,但高于GANT61组(P<0.05);GANT61组G0/G1期、S期和G2/M期增殖率以及GANT61组培养72 h凋亡率均高于DMSO组(P<0.05)。结论 Gli和PLK1异常表达在食管腺癌细胞中存在串活机制,两者可以调节细胞周期和凋亡,在食管腺癌发生发展中发挥重要作用。

Gli-1信号通路对TGF-β1诱导的人胃癌细胞上皮间质转化和侵袭的影响

目的:探讨核转录因子神经胶质瘤关联癌基因同源物1(glioma associated oncogene homolog 1,Gli-1)对转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的人胃癌SGC-7901细胞发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用机制。方法:体外采用10 ng/ml TGF-β1对胃癌SGC-7901细胞进行处理,使用倒置显微镜观察细胞形态变化,RT-PCR和Western blot检测EMT上皮表型蛋白E-cadherin和间质表型蛋白Vimentin的表达水平; Transwell细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力变化,检测TGF-β1对SGC-7901细胞发生EMT的影响;同时采用RT-PCR和Western blot检测Gli-1的mRNA和蛋白表达水平。随后进一步采用Gli-1基因特异性阻断剂GANT 61阻断Gli-1表达,并使用TGF-β1(10 ng/ml)对SGC-7901细胞进行处理,RT-PCR和Western blot检测Gli-1、E-cadherin和Vimentin mRNA及其蛋白表达水平的改变,并使用Transwell细胞侵袭实验检测阻断Gli-1对SGC-7901细胞侵袭能力的影响。结果:TGF-β1可以诱导人胃癌SGC-7901细胞发生上皮间质转化并促进细胞侵袭。TGF-β1可以在mRNA和蛋白水平下调上皮表型蛋白E-cadherin的表达、提高Gli-1和间质表型蛋白Vimentin的表达。TGF-β1可以明显提高SGC-7901细胞侵袭,而阻断Gli-1后可以抑制TGF-β1诱导的人胃癌SGC-7901细胞上皮间质转化和细胞侵袭。结论:胃癌SGC-7901细胞中Gli-1可能参与TGF-β1介导的EMT的发生,Gli-1可能作为胃癌基因治疗中的有效靶点发挥作用。

人胰腺癌细胞株锌指转录因子GLI1及PTCH1基因表达的检测

目的:检测5株人胰腺癌细胞株Hedgehog信号转导通路成员锌指转录因子GLI1、PTCH1基因的表达情况,测定并分析其基因序列。方法:用RT-PCR方法检测5株胰腺癌细胞株及25例正常胰腺组织GLI1、PTCH1 mRNA的表达;纯化、回收目的基因GLI1、PTCH1,将其分别插入克隆载体pTA2,限制性内切酶酶切鉴定,测定序列。结果:5株胰腺癌细胞株均表达GLI1、PTCH1,25例正常胰腺组织均不表达GLI1、PTCH1;成功构建重组质粒pTA2/GLI1、pTA2/PTCH1,测序结果与GeneBank公布的基因序列一致。结论:Hedgehog信号转导通路的过度激活参与了胰腺癌的发生,可能是胰腺癌治疗的潜在新靶标。

GLI1、p-STAT3蛋白在胆囊癌患者中的表达情况及与临床特征的关系

目的探讨神经胶质瘤相关癌基因同源物1(GLI1)、磷酸化信号转导及转录激活因子3(p-STAT3)在胆囊癌患者中的表达情况及与临床特征的关系。方法选取60例胆囊癌患者和60例慢性胆囊炎患者,并取其胆囊癌组织标本和胆囊炎组织标本。采用免疫组织化学染色法检测两组标本中GLI1、p-STAT3蛋白的阳性表达率,分析不同临床特征胆囊癌患者胆囊癌组织中GLI1、p-STAT3蛋白的表达情况。结果胆囊癌组织中GLI1、pSTAT3蛋白的阳性表达率均明显高于胆囊炎组织,差异均有统计学意义(P<0.01)。不同分化程度、Nevin分期、淋巴结转移情况胆囊癌患者胆囊癌组织中GLI1、p-STAT3蛋白阳性表达率比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论GLI1、p-STAT3蛋白在胆囊癌组织中阳性表达率较高,且可能与胆囊癌的分化程度、Nevin分期和淋巴结转移有关。

miR-205靶定YES1对肺癌细胞A549的增殖抑制作用

目的:利用实时定量RT-PCR技术和双荧光蛋白报告基因分析系统检测miR-205在肺癌组织及A549细胞系中的表达水平以及其直接靶基因YES1,探讨miR-205抑制肺癌细胞A549增殖的可能机制。方法:实时定量RT-PCR技术检测10例肺癌组织和10例癌旁正常肺组织中miR-205的表达水平;miR-205 mimics和control mimics分别转染A549细胞,利用细胞计数和集落形成实验检测转染后A549细胞的增殖情况。选取表达绿色荧光蛋白的质粒pcDNA3/EGFP,将YES1 3′UTR的一段特异性序列、YES1 3′UTR(miR-205互补位点)点突变后的序列分别插入该质粒中,构建YES1-3′UTR和mut-YES1-3′UTR的绿色荧光表达质粒。实验分为YES1-3′UTR、YES1-3′UTR与miR-205 mimics、YES1-3′UTR与control mimics、mut-YES1-3′UTR、mutYES1-3′UTR与miR-205 mimics和mut-YES1-3′UTR与control mimics共6组,均与表达红色荧光蛋白pDsRed2-N1共同转染肺癌细胞系A549,荧光分光光度计进行蛋白定性和定量检测。结果:与癌旁正常肺组织比较,miR-205在肺癌组织及A549细胞中表达水平降低(P<0.05);miR-205mimics转染组A549细胞增殖率明显低于转染control mimics对照组(P<0.05);YES1-3′UTR与miR-205mimics共转实验组荧光蛋白表达水平低于YES1-3′UTR与control mimics共转染组(P<0.01);YES1蛋白高表达组A549细胞细胞克隆形成数高于细胞对照组(P<0.05)。结论:miR-205可能通过靶定靶基因YES1抑制了肺癌细胞A549的增殖,提示miR-205和YES1有可能成为肿瘤生物治疗的新靶点。

莪术含药血清抑制大鼠HSC中Gli1和β-catenin表达的机制研究

目的:研究莪术含药血清调节瘦素活化的大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)中刺猬(hedgehog,Hh)信号通路锌指转录因子-1(glioma-associated oncogene homolog-1,Gli1)和Wnt信号通路关键因子β-连环蛋白(β-catenin)表达的机制。方法:按随机数字表法将30只清洁级sprague-dawley(SD)大鼠均分3组,分别给予莪术水煎剂、秋水仙碱、生理盐水灌胃取血制备含药血清。经高效液相色谱法(HPLC)检测血清中莪术成分。体外培养大鼠HSC,分为8组:空白组、模型组、Hh通路抑制剂组、莪术组、Hh通路抑制剂+莪术组、Hh通路激动剂组、Hh通路激动剂+莪术组、秋水仙碱组。除空白组外,其余各组均给予100 ng/m L瘦素诱导后,各组再给予相应药物干预24 h,MTT法检测HSC增殖情况,RT-PCR法检测Gli1 m RNA和β-catenin m RNA表达,Western blot及免疫荧光法检测Gli1和β-catenin蛋白表达。结果:与空白组比较,经瘦素活化的大鼠HSC中Gli1、β-catenin的m RNA和蛋白表达均明显增高(均P=0.000)。与模型组比较,Hh通路抑制剂、莪术含药血清分别干预及莪术含药血清与Hh通路抑制剂协同干预后,Gli1、β-catenin的m RNA和蛋白表达均明显降低(均P=0.000);秋水仙碱含药血清干预后,Gli1 m RNA和蛋白明显降低(P=0.000,P=0.007),β-catenin m RNA和蛋白表达均明显降低(均P=0.000);Hh通路激动剂干预后,Gli1、β-catenin的m RNA和蛋白表达均明显增高(均P=0.000)。与Hh通路激动剂组比较,用莪术含药血清干预Hh通路激动剂组后,Gli1、β-catenin的m RNA和蛋白表达均明显降低(均P=0.000)。结论:莪术含药血清可通过下调瘦素诱导活化的大鼠HSC中Gli1的表达,参与Hh信号通路抑制HSC的活化与增殖,并能通过下调Gli1的表达而下调Wnt信号通路关键因子β-catenin的表达,抑制HSC活化与增殖,从而抑制肝纤维化。