谷氨酰胺高产菌株在不同NH_4^+浓度下的基因差异表达

GH15菌株在高NH_4^+浓度下能够积累过量的谷氨酰胺,并且随着NH_4^+浓度的增加,谷氨酰胺的产量逐渐增加,但谷氨酸的产量却逐渐降低,这表明该菌株在不同NH_4^+浓度下其高胞内的氮代谢及调控行为有很大的改变。利用抑制消减杂交技术分别构建了NH_4^+菌株在高NH_4^+浓度下和低NH_4^+浓度下的基因表达抑制消减文库。通过对文库的测序得到了35个差异表达的基因。这些差异基因主要是细胞生长相关基因、能量代谢基因以及氨基酸合成代谢相关的基因,我们认为正是这些基因差异导致该菌株在高NH_4^+下高产谷氨酰胺。

一株谷氨酰胺合成酶高产菌株的酶学分析及其基因的克隆分析

对谷氨酰胺合成酶菌球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)突变菌株Y3进行分析.其谷氨酰胺合成酶摇瓶发酵单位是原始菌株的2.81倍;最适反应温度为40℃;最适pH为6.5.以突变菌株和原始菌株基因组为模板,通过同源克隆策略,成功地获得了球形节杆菌谷氨酰胺合成酶基因gln片段.通过序列比对,突变菌株gln基因在第409 bp处产生T→C的碱基的突变,该处突变使酪氨酸(Tyr409)被组氨酸(His409)取代,该突变解决了谷氨酰胺合成酶腺苷酰基化问题,保证了其在高浓度铵盐条件下保持酶活性.

紫外诱变选育谷氨酰胺合成酶高产菌株及其酶学性质研究

[目的]采用紫外诱变的方法选育谷氨酰胺合成酶高产菌株,并对其酶学性质进行研究。[方法]以紫外诱变选育谷氨酰胺合成酶产生菌Arthrobacter globiformis A0014,通过测定其谷氨酰胺合成酶酶活力,获得高产突变株,之后进一步对其酶学性质进行研究。[结果]获得高产突变株Y3。该菌株经多次传代,遗传性状稳定,其谷氨酰胺合成酶摇瓶发酵单位是出发株的2.81倍。突变株谷氨酰胺合成酶最适反应温度为40℃,最适pH值为6.5。[结论]所获得的突变株酶活的提高以及最适反应温度的下降有利于酶法合成谷氨酰胺,在工业生产中将有较好的应用前景。

2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌球状节杆菌K1022抗噬菌体菌株的选育

从 2 酮基 D 葡萄糖酸产生菌球状节杆菌K10 2 2的异常发酵液中分离到 3种噬菌体 ,分别将其命名为KS2 11、KS2 12和KS2 13。采用紫外诱变或自然选育的方法 ,获得了 6株具有抗噬菌体能力的 2 酮基 D 葡萄糖酸高产菌株。研究了抗株C2 2 4和K2 32的遗传稳定性 ,并在 5 0kL的发酵罐上进行了发酵生产试验。结果表明 ,经多次传代 ,菌株C2 2 4和K2 32对噬菌体的抗性及其发酵产酸能力没有改变 。

黄嘌呤氧化酶产生菌的离子注入诱变及其二步发酵的研究

采用剂量 1.0× 10 1 2 ～ 1.0× 10 1 6ions cm2 的N+注入产黄嘌呤氧化酶的球形节杆菌ATCC80 10 ,研究其诱变效果。结果表明 :细菌的存活曲线呈现特殊的“马鞍形” ,菌落形态和颜色发生了变化 ,且变化与产酶量有关 ,经过筛选获得了遗传性能稳定的高酶活突变株 ,使酶活较出发菌提高了 43.0 %。改进发酵工艺 ,采用二步发酵其酶得率是一步发酵的 4.75倍。

球形节杆菌C224分批发酵2-酮基-D-葡萄糖酸的条件优化及其动力学模型的构建

通过优化发酵条件,提高球形节杆菌C224菌株利用大米淀粉水解糖分批发酵2-酮基-D-葡萄糖酸的生产强度,并在此基础上构建其发酵动力学模型。在50 L的发酵罐上考察了通气量与葡萄糖浓度对2-酮基-D-葡萄糖酸发酵的影响,并基于Logistic方程、Luedeking-Piret方程和物料平衡计算分别构建了菌体生长、产物形成和底物消耗的动力学模型。研究结果表明,通气量低于1.5 v.v-1.m-1时,发酵生产强度明显减小,糖酸转化率有所降低;发酵培养基中的葡萄糖浓度以120.0～180.0 g/L为宜,过高或过低对生产强度和糖酸转化率均有不利影响。在适宜的发酵条件下,球形节杆菌C224菌株分批发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的生产强度达6.36～6.54 g/(L.h),糖酸转化率为0.96～0.97 g/g。所构建动力学模型的计算值与实验值拟合效果良好,各项模型的相关系数R2均大于0.95,说明其能够揭示球形节杆菌C224分批发酵2-酮基-D-葡萄糖酸代谢基本特征。

一株高产谷氨酰胺合成酶的LNU 0165菌的鉴定

谷氨酰胺合成酶是应用广泛的生物酶类,以LNU 0165为实验出发菌株,对不同pH、温度条件下产谷氨酰胺合成酶的最佳发酵条件进行了研究,通过测定其谷氨酰胺合成酶酶活力,确定LNU 0165为高产菌株.从分子水平上对该菌株进行16S rRNA序列分析及同源性比较,以及生理生化的鉴定.根据LNU0165菌株16S rRNA与GenBank数据库中Arthrobacter globiform is的16S rRNA的序列具有99%的同源性,确定LNU 0165为球形节杆菌(Arthrobacter globiform is).

利用黄嘌呤氧化酶提高病毒唑转化率

研究了纯牛奶黄嘌呤氧化酶对病毒唑合成有促进作用,进而选育具有高活性黄嘌呤氧化酶的球形节杆菌ATCC8010 代替纯酶,证实了非增殖的完整球形节杆菌细胞也对病毒唑合成有促进作用.为病毒唑的酶法合成提供了一种新的方法和思路.

表面活性剂强化球形节杆菌修复DDTs污染农田土壤的现场实验

通过田间实验,研究了不同浓度的表面活性剂(SDBS-TW80和RL)对球形节杆菌Arthrobacter globiformis DC-1降解设施农业土壤中DDTs效果的影响。结果表明,SDBS-TW80和RL均能不同程度地促进球形节杆菌降解农田土壤中DDTs。当SDBS-TW80和RL浓度分别为200和5 mg·kg-1土时,DDTs的降解率达到最高,均为64%左右。DDTs组分分析表明:SDBS-TW80和RL对p,p'-DDE、p,p'-DDT、p,p'-DDD和o,p'-DDT 4种组分均有不同程度的降解,其中毒性最强的p,p'-DDE降解效果最好,最高达75%左右。实验结果证实了利用表面活性剂强化球形节杆菌现场修复DDTs污染土壤的可能性。考虑到修复效率和成本,实际应用中优先选择SDBS-TW80的组合。

球形节杆菌尿酸酶的表达、纯化及其活性

目的在大肠埃希菌中表达球形节杆菌尿酸酶(uricase,Uri),并进行纯化和检测其活性。方法根据大肠埃希菌遗传密码子偏爱性,结合原核翻译起始序列的局部二级结构自由能最小化原则,优化设计编码Uri蛋白的核苷酸序列,经PCR扩增球形节杆菌uri基因,克隆至载体pET43.1a,构建重组表达质粒pET43.1a-uri,转化感受态大肠埃希菌BL21-odonPlus(DE3)-RIPL,IPTG诱导表达。表达产物经硫酸铵粗纯及DEAE琼脂糖凝胶层析纯化后,经SDS-PAGE分析纯度;参考Uri产品说明书测定蛋白酶活性,并确定其最佳检测温度及pH值。结果重组表达质粒pET43.1a-uri经酶切及测序鉴定构建正确;重组蛋白相对分子质量约33 000,以可溶性形式存在,表达量约占菌体总蛋白的40%;纯化后纯度可达90%以上;酶活性达13.2 U/mg,酶活性检测最佳反应温度为40℃,最佳反应pH值为9.0。结论成功于大肠埃希菌中表达了uri基因,并获得高纯度的Uri蛋白,其酶学性质与天然的球形节杆菌尿酸酶基本一致,为其大规模稳定生产及尿酸酶法检测试剂的配制研究奠定了基础。