亮氨酸对血糖的影响及其相关机制研究

目的探讨亮氨酸对血糖水平的影响及其机制。方法将45只昆明小鼠随机分为3组,每组15只。亮氨酸低剂量组给予2.0g/kg葡萄糖和0.7g/kg亮氨酸混合液,亮氨酸高剂量组给予2.0g/kg葡萄糖和2.0g/kg亮氨酸混合液,对照组均仅给予2.0g/kg葡萄糖,灌胃后0.5h、1h、2h检测血糖。为排除亮氨酸本身对肠道葡萄糖吸收的影响给予淀粉糖耐量实验,亮氨酸组给予2.0g/kg淀粉和2.0g/kg亮氨酸混合液,对照组给予2.0g/kg淀粉,灌胃后0.5h、1h、2h检测血糖。在灌胃葡萄糖和亮氨酸后0.5h眼眶取血,ELISA方法测定血样胰岛素和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)。结果亮氨酸低剂量组0.5h、1h血糖及血糖曲线下面积(AUC)显著低于对照组,亮氨酸高剂量组在0.5h、1h血糖及AUC显著低于对照组,亮氨酸低剂量组与高剂量组0.5h血糖有显著差异。亮氨酸组灌胃给予淀粉0.5h、1h血糖及AUC显著低于对照组。亮氨酸高剂量组胰岛素和GLP-1水平均显著高于对照组(P<0.05),而亮氨酸低剂量组上述指标较对照组无显著性差异。结论亮氨酸通过促进胰岛素和GLP-1分泌来降低血糖。

胰高血糖素样肽1受体N端片段与exendin-4的亲和位点分析

通过易错PCR(epPCR)方法建立了一个鼠肺的胰高血糖素样肽1受体(GLP-1R)N端片段的噬菌体随机突变展示肽库。根据筛选出的突变体来分析突变后胰高血糖素样肽1受体N端片段(nGLP-1R)与exendin-4结合活性。实验结果显示:保守的半胱氨酸C26发生突变后并未引起nGLP-1R与其配体exendin-4结合能力的改变,第101位和108位氨基酸是nGLP-1R与exendin-4结合的潜在位点。

人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达

目的:在巴斯德毕赤酵母中表达有降糖活性的人胰高血糖素样肽-1(hGLP-1)突变体(2Gly-hGLP-1)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白。方法:为将GLP-1氨基酸序列第2位的丙氨酸(Ala)定点突变为甘氨酸(Gly),根据毕赤酵母偏爱密码子合成编码2Gly-hGLP-1的基因;采用重叠PCR法拼接2Gly-hGLP-1和HSA的基因,使得2Gly-hGLP-1的C端与HSA的N端通过甘氨酸五肽接头连接;将该融合基因插入表达载体pPIC9构建为重组载体pPIC9/2Gly-hGLP-1-HSA,电击转化至毕赤酵母GS115细胞,通过表型筛选和诱导表达实验获得高效表达菌株;工程菌在5L发酵罐中培养后,对发酵产物进行分离纯化和生物学活性分析。结果:融合蛋白在5L发酵罐中的表达量约为200mg/L,经纯化后纯度可达95%以上;小鼠糖耐量实验表明该融合蛋白具有明显的控血糖活性。结论:在毕赤酵母中分泌表达的融合蛋白2Gly-hGLP-1-HSA具有降血糖活性。

Ⅱ型糖尿病并发急性脑梗塞患者ET、INS、GC RIA及其临床意义

目的:探讨Ⅱ型糖尿病合并急性脑梗塞与血管内皮素(ET)、胰岛素(INS)及胰高血糖素(GC)水平的关系,以阐明其在脑卒中发生发展过程中的临床意义。方法:采用RIA对36例本病患者进行急性期与恢复期ET、INS及GC含量的测定,并与正常对照组作比较。结果:急性期ET(96.89±23.61ng/L)、INS(24.42±9.84mIU/L)、GC(227.52±71.24ng/L)显著高于恢复期(依次为65.16±12.57ng/L、15.52±5.66mIU/L、178.26±52.76ng/L)及正常对照组(p<0.05～0.001)。结论:本病患者存在ET、INS及GC明显分泌异常,说明其参与了糖尿病脑卒中的病理生理及发生发展过程,动态RIA其血中含量,对判断病情程度、疗效、转归及预后评估具有重要的临床意义。

汉防己甲素对正常大鼠糖代谢作用的初步观察

本研究观察了汉防己甲素对正常大鼠血糖、血清胰岛素和血浆胰高血糖素水平的影响,结果表明:汉防己甲素(100mg/kg)腹腔注射后,血糖于0.5h明显升高(P<0.01),3h达高峰,7h恢复到空腹水平,24h血糖明显降低(P<0.05);血清胰岛素水平于给药后0.5h明显下降(P<0.05),7h降至更低水平(P<0.01),24h明显升高(P<0.01);血浆胰高血糖素水平于给药后0.5h至5h有逐渐增高的趋势。

噬菌体表面展示技术筛选胰高血糖样肽1受体N端片段的Exendin-4亲和位点

[目的]通过噬菌体表面展示技术寻找胰高血糖素样肽1受体N端片段(nGLP-1R)结合Exendin-4的关键位点。[方法]通过易错PCR建立一个鼠肺nGLP-1R(从第21个氨基酸到第145个氨基酸)的噬菌体随机突变展示肽库。根据筛选出的突变体分析突变后nGLP-1R与Exendin-4结合活性。[结果]nGLP-1R第30位、第46位和第92位氨基酸是其与Exendin-4结合的潜在位点。[结论]关键位点单个氨基酸残基的突变可以改变nGLP-1R蛋白质的生物学活性。

聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物的修饰条件优化

用化学合成法获得C末端氨基酸为半胱氨酸的Byetta类似物(ByC39),再采用分子量为40 kDa的马来酰亚胺活化单甲氧基聚乙二醇(mPEG-mal-40kDa)对ByC39的半胱氨酸巯基进行定点修饰,修饰产物通过阳离子交换层析和反向层析纯化获得。在已建立的定点修饰反应和分离纯化工艺基础上,通过改变反应条件中修饰pH值、修饰缓冲体系,以及修饰保护剂等因素来得到优化修饰条件:pH值为6.5的CH3COONa-CH3COOH缓冲液,保护剂为2.0mmol/L Lys和5.0 mmol/L EDTA,mPEG-mal-40 kDa/ByC39摩尔比3∶1,25℃反应4 h;经SDSPAGE和RP-HPLC检测,可知提高了修饰率以及增加了修饰产物的稳定性;最后加入TFA终止反应。

Exendin-4及其类似物的研究近况

Exendin-4是一种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体的长效激动剂,与GLP-1具有53%的序列同源性,具有促进葡萄糖依赖性的胰岛素分泌、促进β细胞增殖、减慢胃排空、抑制食物摄取和减轻体重等作用,有望成为治疗2型糖尿病的理想药物。综述Exendin-4的结构、药理作用、制备方法、结构修饰改造的策略,介绍首个用于临床的Exendin-4类药物Exenatide,并对Exendin-4及其类似物的发展前景进行了展望。

Exenatide及其类似物的研究进展

Exenatide是由Amylin Pharmaceuticals与礼来(Eli Lilly)公司共同开发的胰高血糖素样肽-1(glu-cogan-like peptide-1,GLP-1)受体长效激动剂。研究证实,exenatide具有促进胰岛β细胞增殖、抑制β细胞凋亡、抑制食物摄取、减慢胃排空和减轻体质量等生理作用,有着传统治疗糖尿病药物不可比拟的优点,因而近年exenatide及类似物已经成为糖尿病治疗领域的研究热点。

保守的第52位色氨酸突变引起的胰高血糖素样肽1受体N端片段活性丧失

通过易错PCR方法建立了一个鼠肺不同长度的nGLP-1R(从第21个氨基酸开始到第145个氨基酸)的噬菌体随机突变展示肽库,通过噬菌体表面展示技术检测胰高血糖素样肽1受体N端片段(nGLP-1R)在缺失一段或两段基因后是否还具有结合Exendin-4的活性。经ELISA分析发现了一株无结合活性的突变株,命名为EP16。经测序比对,发现EP16缺失了前20个和后10个氨基酸,且第52位色氨酸突变为精氨酸。为确定EP16与Exendin-4无结合活性的原因,重新构建了无前20个和后10个氨基酸的EP16野生型及第52位色氨酸变为精氨酸的全长nGLP-1RW52R与EP16进行对比分析。结果表明,EP16的活性丧失是由保守的第52位色氨酸突变为精氨酸引起的,缺失的前20个和后10个氨基酸没有影响其生物学活性。关键位点单个氨基酸残基的突变可以改变胰高血糖素样肽1受体N端片段整个蛋白质的生物学活性。