海洋低温葡萄糖氧化酶细菌选育及其酶学性质研究

为获得产低温葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)的细菌,提高其产酶能力,研究GOD酶学性质,通过平板显色法从海泥样品中筛选低温GOD生产菌株,经形态特征、生理生化鉴定及分子生物学鉴定确定菌株分类。经诱变育种获得高产GOD菌株,并对所产GOD进行酶学性质研究。研究获得1株编号8-Ⅲ的高产低温GOD细菌,鉴定为柠檬酸杆菌属(Citrobacters sp.8-Ⅲ),产GOD酶活力为0.75U/mL。经诱变得到可稳定遗传的突变菌株8-Ⅲ-a44,产GOD酶活力为1.77U/mL,为原始菌株的2.36倍。最适pH为6.5,最适作用温度为15℃,在0~35℃有较高酶活力,为低温酶。并且添加K^+、Ni^2+对GOD活性有明显促进作用。该研究为其在海产品保鲜、饲料防腐方面的应用奠定基础。

海洋细菌低温葡萄糖氧化酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

为解决细菌葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)活力较低的问题,提取和纯化了实验室保藏海洋细菌 Citrobacters sp. 8-III的基因组DNA,并与现存GOD基因比对获得目的序列,以此序列为模板获得GOD基因。将人工合成并密码子优化的GOD基因亚克隆至载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28a(+)-GOD并转化到 E. coli BL21(DE3)中实现表达。经镍柱亲和层析得到较纯的重组GOD,并对其进行酶学性质研究。实验成功构建了产GOD的E. coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-GOD,目的蛋白约46 kDa。重组GOD酶活为2.04 U/mL,该酶最适作用温度为25 ℃;最适作用pH为6.0;K^+、Ni^2+对GOD的活性有明显促进作用;重组GOD添加至饲料中可加快雏鸡生长,且具备一定防腐功效。该研究首次将海洋细菌GOD基因导入大肠杆菌中,开拓GOD外源表达新的宿主。同时重组GOD具备低温酶特性,为其在饲料添加剂和低温领域应用奠定了基础。

聚合膜固定葡萄糖氧化酶及酶活性分析

采用电化学石英晶振阻抗分析法,测定了中性缓冲溶液中葡萄糖氧化酶在去甲肾上腺素电氧化聚合膜中固定化酶的量;并结合安培法,定量检测了固定化酶(ESAi)和游离酶(ESAn)的比活性以及固定化酶相对于游离酶的酶相对比活性(ERA)。另外,采用扫描电化学显微镜(SECM)监测了酶电极检测电位下"泄漏"H2O2的氧化电流,并分析该泄漏电流的存在可能是引起酶电极ERA偏低的重要原因。

一种分离葡萄糖氧化酶的方法

A method for separation of glucose oxidase(GOD) has been developed. A chroma tographic column is filled with an anion exchanger of styrene divinyl benzene matrix conta ining quaternary ammonium salt. The buffered phosphate and acetate solutions were used as eluents. Two GOD components(GOD A and GOD B) were separated by this method. Their enzyme activity and ζ potential values were 86 9, 27 3, and -4 3 mV, -6 4 mV, respecti vely . The simplicity and low cost of the method make it valuable for practical applications.

葡萄糖氧化酶产生菌的紫外诱变及发酵条件优化

利用紫外诱变黑曲霉的方法产生葡萄糖氧化酶并研究酶的最适发酵条件。以酶活力、蓝紫色透明圈的直径为主要指标,确定了紫外诱变法最佳诱变条件为:15 W的紫外灯在照射时间为8 min,照射距离20 cm处,获得1株优良的正向突变株,其产葡萄糖氧化酶的能力是出发菌株的11.8倍。并且通过单因素实验,确定酶的最适发酵条件。实验结果表明:在30℃、5%接种量、转速160 r/min条件下恒温培养72 h,为酶的最适发酵条件,优化后酶活力是优化前的9.56倍。