外源添加VB_(12)对肺炎克雷伯氏菌代谢3-羟基丙酸的影响

为了探究外源添加维生素B12(Vitamin B12,VB_(12))对Klebsiella pneumoniae HD79和K.pneumoniae HD79-T利用甘油还原途径生产3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid,3-HP)的影响以及摸索VB_(12)对K.pneumoniae HD79和K.pneumoniae HD79-T的阈值上限,将不同浓度(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/L)的VB_(12)添加到K.pneumoniae HD79及K.pneumoniae HD79-T的发酵培养基中,利用HPLC检测其底物消耗及产物产生情况、qRT-PCR检测还原途径相关基因的mRNA表达情况以及酶联免疫试剂盒检测代谢相关酶活性。结果表明,VB_(12)对K.pneumoniae HD79和K.pneumoniae HD79-T的阈值为0.01 g/L和0.03 g/L。与未添加VB_(12)相比,菌株K.pneumoniae HD79和K.pneumoniae HD79-T的3-HP产量分别提高了24.39%,8.86%;醛脱氢酶基因puuC表达量分别提高了2.49倍和1.68倍;ALDH、GDHt和PDOR的酶活力分别提高了50.24%、40.36%和18.29%,及30.49%、37.84%和13.56%。说明通过外源添加辅酶因子VB_(12)对肺炎克雷伯氏菌高产3-HP是可行策略。

克雷伯杆菌甘油脱氢酶的分离纯化及性质

在有氧条件下,利用Q Sepharose Fast Flow离子交换层析和Blue Sepharose CL 6B亲和层析提纯克雷伯杆菌胞内甘油脱氢酶.酶的纯化倍数和回收率分别为 32.61 倍和 5.83%.通过SDS PAGE电泳测得该酶亚基的相对分子质量约为 34 000.该酶最适表观反应温度和最适反应pH值分别为60 ℃和11.在30 ℃以下及pH值10~12时,该酶具有良好的稳定性.在45 ℃和pH值11条件下,该酶以甘油和NAD+为底物的米氏常数Km分别为 0.75 mmol/L和 0.12 mmol/L.甘油脱氢酶对甘油的生理反应活性最大,对其它醇类如 1,2 丙二醇、乙二醇也有氧化能力.NH4+和Na+对酶有显著激活作用.巯基保护剂可明显地提高酶的活力.

克雷伯杆菌甘油脱氢酶基因的克隆表达与纯化

以克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)基因组DNA为模板,运用PCR扩增得到编码甘油脱氢酶(GDH)的基因(gldA),并克隆到pMD-18T载体上,构建克隆载体pMD-gldA。经测序正确后,将gldA亚克隆至表达载体pET-32a(+)上构建表达质粒pET-32gldA。在乳糖诱导下,携带pET-32gldA的E.coli BL21(DE3)高效表达分子量约为54kD的可溶性蛋白。表达产物带有His6-tag标记,选用Ni柱对表达产物进行纯化,纯化后酶液的比活为188u/mg,纯化倍数和回收率分别为3倍和67.5%。

不同醛脱氢酶对重组克雷伯氏菌生产3-羟基丙酸的影响

PCR扩增Cupriavidus necator Gab D4和Azospirillum brasilense KGSADH醛脱氢酶基因,分别与经改造获得卡那霉素抗性的p UC19质粒(p UC19Kan)连接,再转化至Klebsiella pneumoniae DSM2026,获得重组菌KpKan/KGSADH和KpKan/Gab D4。经摇瓶发酵,KpKan/KGSADH和KpKan/Gab D4的最高3-羟基丙酸(3-HP)产量分别为3.66与2.56 g/L,与未导入醛脱氢酶的K.pneumoniae对照菌相比,分别提高了352%与216%。对其他产物的研究表明,2株重组菌的1,3-丙二醇(1,3-PDO)的产量低于对照菌,而2,3-丁二醇(2,3-BD)和乙酸产量高于对照菌。该研究首次将C.necator Gab D4醛脱氢酶基因导入K.pneumoniae,并对比了KpKan/KGSADH与KpKan/Gab D4的3-HP产量,实验中确定的性能优良的发酵菌株为继续提高3-HP产量提供了帮助。

重组肺炎链球菌甘油脱氢酶活性及晶体培养的初步分析

甘油脱氢酶能够氧化胞内甘油为代谢活动提供能量,并参与调控宿主粘附相关细菌蛋白质的表达,是潜在的抗菌药物靶点.本文利用大肠杆菌BL21原核表达肺炎链球菌甘油脱氢酶,获得大量上清表达的目的蛋白.再用Ni-NAT-Sepharose Fast Flow亲和层析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析以及Superdex 200分子筛进行纯化.经数据拟合,证实该酶在溶液中以同源二聚体形式存在.光谱实验证实,该重组表达甘油脱氢酶仍具有氧化甘油生成1,3-二羟基丙酮的活性.用Hampton试剂盒初筛晶体及棋盘法优化晶体,在0.1 mol/L Bicine pH 9.6,13%PEG MME 5000,0.2 mol/L KSCN,4%Dioxone条件下,得到了晶型好且有一定衍射能力的单晶,为解析肺炎链球菌甘油脱氢酶的三维结构及研究结构与酶活之间的关系奠定了基础.

应用易错PCR定向进化甘油脱氢酶

经过连续易错聚合酶链式反应(Error-Prone PCR)向克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)甘油脱氢酶基因中引入突变,并构建突变文库.依据突变体催化番红O显色的特性,采用琼脂平板法和96微孔板法相结合的高通量筛选方法,成功获得突变体gldA-74,其酶活力是亲本重组酶的2.73倍.通过软件对突变体gldA-74酶基因和亲本重组酶基因进行分析对比,发现突变体gldA-74酶基因发生了一处点突变(A964T),该突变使一处氨基酸被取代.将亲本重组酶和进化酶的高效表达产物经Ni柱纯化后,酶学性质的测定结果表明,甘油的Km值由0.58 mmol.L-1升高至0.63 mmol.L-1,而NAD的Km值由0.74 mmol.L-1升高至0.77mmol.L-1,并且酶的最适pH值由原来的11.5升高至12.5,而最适温度由65℃降至55℃.

黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌外膜蛋白A的原核表达与纯化

【目的】克隆黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌外膜蛋白A(KpOmpA)基因,构建重组质粒并诱导其表达,纯化获取重组蛋白KpOmpA,为黄喉拟水龟抗肺炎克雷伯菌的相关疫苗研究奠定基础。【方法】以黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌DNA为模板,克隆获得KpOmpA基因后与pET-32a表达载体连接;将构建的重组质粒pET-32aKpOmpA转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,通过SDSPAGE电泳检测KpOmpA重组蛋白的表达情况,并对重组蛋白进行可溶性分析;经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化KpOmpA重组蛋白,应用Western blot方法鉴定纯化蛋白。【结果】KpOmpA基因CDS序列全长为1071 bp,推定编码356个氨基酸,与其他肺炎克雷伯菌的OmpA氨基酸序列同源性超过99%,高度保守。重组质粒pET-32a-KpOmpA经双酶切、测序确认基因序列无移码或突变,表明重组质粒成功构建。转化后的BL21感受态细胞经终浓度为1 mmol/L IPTG在37℃下诱导4 h后进行SDS-PAGE检测,结果表明,KpOmpA重组蛋白大量表达,以包涵体形式存在,分子量约为57 kD。经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化,获得较高纯度的重组蛋白。Western blot检测结果显示有57 kD的条带,表明KpOmpA重组蛋白能被小鼠抗His-tag单克隆抗体识别。【结论】成功构建了重组质粒pET-32a-KpOmpA,在大肠杆菌表达系统中诱导其表达,并纯化得到较高纯度的KpOmpA重组蛋白,为制备预防肺炎克雷伯菌感染的疫苗奠定基础。

重组基因工程大肠杆菌制备1,3-二羟基丙酮

目的探寻甘油发酵合成1,3-二羟基丙酮(DHA)的高效工程菌。方法以肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板,运用PCR扩增到编码甘油脱氢酶(GDH)的基因(gldA),并克隆到大肠杆菌表达载体pET28a上,构建重组表达质粒pET-gldA;将其转入大肠杆菌E.coli JM109,经筛选后获得了DHA重组基因工程菌。结果该工程菌在含有甘油的培养基中发酵后的次级代谢产物经分离纯化,通过1H和13C核磁共振谱确定为目标产物DHA,产量≥120 g/L。发酵液经过滤、有机溶剂萃取和结晶后,获得高质量DHA。结论该二菌株的基因能够高效重组,并获得甘油发酵合成DHA的重组基因工程菌的成功表达。

克雷伯氏菌甘油脱氢酶dhaD的克隆表达、纯化及酶学性质研究

以克雷伯氏菌基因组DNA为模板,扩增得到编码甘油脱氢酶(GDH)的基因dhaD,将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)上,在E.coliBL21(DE3)中诱导表达,利用表达载体pET-28a(+)上的6.His-Tag标记选用Ni柱亲和层析法纯化表达具有活性的甘油脱氢酶(GDH),纯化后比酶活达到156U/mg,纯化倍数达4.6倍,回收率为67.4%。并初步研究了该酶的酶学性质,酶反应的最适pH为11.0,在pH7.0～12.0范围内稳定;酶反应的最适温度为30℃,稳定范围为25～45℃;酶动力学参数以甘油为底物的Km为0.54 mmol/L,Vmax为0.49μmol/ml·min。

肺炎克雷伯菌调控蛋白RcsAB的构建表达及活性鉴定

为了探讨转录调控子Rcs AB对靶基因的转录调控作用,构建肺炎克雷伯菌RcsA和RcsB的重组质粒,之后诱导蛋白表达,提取纯化后测定其活性。PCR得到rcsA、rcsB片段,分别将两DNA片段克隆至表达载体pMAL-C5X、pET28a,构建重组质粒。再将重组质粒导入E. coli BL21(DE3)菌株中,经IPTG诱导后收集菌体,超声破碎。破碎后的上清过柱、透析纯化,得到高纯度的蛋白,通过EMSA进行蛋白活性鉴定。RcsA,RcsB蛋白成功表达纯化,并能够与靶基因结合,初步证明蛋白具有生物学活性。成功制备有生物学活性的RcsA、RcsB蛋白,为进一步研究RcsAB蛋白复合物特异的生物学功能提供物质基础。

重组肺炎克雷伯氏菌转化甘油为聚3-羟基丙酸

聚3-羟基丙酸[Poly(3-hydroxypropionate),P3HP]是一种生物可降解及生物相容的新型聚羟基脂肪酸酯。目前已鉴定的生物均不能天然合成P3HP。采用PCR克隆鼠伤寒沙门氏菌的丙醛脱氢酶(Pdu P)基因及罗尔斯通氏菌的聚羟基脂肪酸酯合成酶(Pha C)基因,构建共表达载体,转化肺炎克雷伯氏菌后获得两株重组菌。以甘油为唯一碳源进行摇瓶发酵,pdu P和pha C共用tac启动子的工程菌K.p(p ET-tac-pdu P-pha C)产生0.054 g/L的P3HP,而pdu P和pha C各自独用tac启动子的工程菌K.p(p ET-tac-pdu P-tac-pha C)产生0.091 g/L的P3HP。

辅酶A依赖的丙醛脱氢酶基因的克隆、表达及其对宿主菌生长的影响

辅酶A依赖的丙醛脱氢酶(Pdu P)是以甘油为底物催化合成聚3-羟基丙酸的关键酶。本研究从鼠伤寒沙门氏菌基因组中PCR扩增了pdu P基因,构建表达载体后转化肺炎克雷伯氏菌,得到重组菌K.p(p ET-pk-pdu P)。SDS-PAGE显示Pdu P实现了高效表达。生长曲线表明重组菌延迟进入平稳期,生物量较空质粒对照菌提高了24.68%,1,3-丙二醇和2,3-丁二醇的产量分别达到16.58 g/L和15.68 g/L,甘油转化率比空质粒对照菌和原代菌分别提高了40.62%和34.02%。上述结果表明,过表达pdu P重排了代谢流量,促进了菌体生长。

肺炎克雷伯菌FimA的表达纯化及多克隆抗体的制备

目的表达及纯化肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)菌毛FimA蛋白并制备多克隆抗体。方法在Clustal Omega网站上比对不同细菌FimA蛋白的同源性。设计特异引物,PCR扩增肺炎克雷伯菌FimA基因,双酶切后将其连接到表达质粒pET28a,构建重组质粒pET28a-FimA。将pET28a-FimA转化表达菌BL21 star(DE3)后培养,使用IPTG诱导FimA蛋白表达。使用IEDG在线网站分析FimA蛋白的B细胞表位,然后用层析纯化的重组FimA蛋白免疫小鼠,获得免疫血清,ELISA检测IgG、IgG1、IgG2a和IgA.结果肺炎克雷伯菌的FimA与其他FimA蛋白同源性较低,为23.6%?30.6%。构建的重组质粒PET28a-FimA在大肠埃希菌中能表达21.6×10^3的重组FimA蛋白,经亲和层析后得到单一电泳条带的高纯度目的蛋白。用FimA蛋白免疫小鼠,获得高滴度的IgG和IgA,且IgG2a的A450值高于IgG1.结论成功构建了表达质粒pET28a-FimA,获得高纯度的重组蛋白FimA。FimA具有免疫原性,用该蛋白免疫小鼠获得高滴度的多克隆抗体。

肺炎克雷伯菌烷基过氧化氢还原酶C的表达纯化及其活性测定

目的表达、纯化肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)烷基过氧化氢还原酶C(Alkyl hydroperoxide reductase C,Ahpc)并测定其活性。方法利用Clustal Omega分析不同细菌Ahpc蛋白的同源性;利用生物信息学方法分析肺炎克雷伯菌Ahpc蛋白的生物学特性。根据Ahpc基因,设计PCR引物,以肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板,PCR扩增Ahpc基因,双酶切后将其连接到pET28a,获得重组质粒pET28a-Ahpc。将重组质粒转化大肠埃希菌,使用IPTG诱导重组Ahpc蛋白的表达,使用亲和层析纯化目蛋白,采用氧化铁二甲酚橙法测定Ahpc蛋白降解叔丁基过氧化氢活性。结果肺炎克雷伯菌Ahpc蛋白含有两个半胱氨酸的经典过氧氧化还原蛋白,定位在细菌细胞质,无跨膜结构域。其α螺旋、β片层以及无规卷曲的含量分别为27.8%,19.7%和52.4%。三级结构是由10个同源的Ahpc蛋白组成同源多聚体。Ahpc蛋白具有多个B细胞表位。PCR扩增得到564bp的Ahpc基因,构建的pET28a-Ahpc重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)后能表达分子质量单位约为24.7ku的重组Ahpc蛋白。亲和层析法获得纯度较高的重组Ahpc蛋白,纯化的重组蛋白能降解丁基过氧化氢。结论成功表达了肺炎克雷伯菌Ahpc蛋白,该蛋白纯化后仍具有降解能够降解丁基过氧化氢的活性,为肺炎克雷伯菌的抗氧化机制研究奠定了基础。