禽马立克氏病毒糖蛋白B基因在家蚕中的表达

将马克克氏病毒（Marek'sdiseasevirus，MDV）糖蛋白B（gB）基因克隆入转移载体pBac－PAK8中，得到重组转移载体质粒pBacPAK（gB）。经限制性酶切图谱结合Southernblot分析鉴定表明，gB基因以正确方向插入转移载体，受多角体蛋白基因启动子控制。将此转移载体与经CvnI酶切线性化的亲本病毒Bm－BacPAK6DNA通过脂质体法共转梁家蚕细胞，只有发生重组的病毒才有复制增殖的能力。然后通过蓝白斑筛选、结合点杂交，纯化得到重组的空斑病毒vBM，用该重组病毒接种家蚕5龄幼虫，对表达产物进行SDS－PAGE分析，检测到gB基因在家蚕中高效表达，表达产物的分子量主要为97KD，表达量约为1mg／mL血淋巴。

马立克氏病病毒Rispens株和RL株B抗原基因的分离、克隆及初步酶切分析

将马立克氏病病毒（ＭＤＶ）血清Ⅰ型Ｒｉｓｐｅｎｓ株和ＲＬ株分别接种于原代鸡胚成纤维细胞，待出现８０％以上细胞病变后收获，经蛋白酶Ｋ消化，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀细胞和病毒的总ＤＮＡ（ｔｏｔａｌＤＮＡ）。以此为模板，根据已发表的Ｂ抗原基因核苷酸序列设计１对引物，通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增出１条约２．８５ｋｂ的特异性条带，斑点杂交证实其为Ｂ抗原基因。双酶切消化后，克隆到质粒ｐＵＣ１９中。酶切分析表明，在这２株病毒的Ｂ抗原基因上，ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ的酶切位点分布与超强毒ＲＢＩＢ株、标准强毒ＧＡ株的完全相同。

马立克氏病病毒Rispens株B抗原基因的克隆及其重组鸡痘病毒的构建

马立克氏病病毒（Ｍａｒｅｋ’ｓＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ，ＭＤＶ）是马立克氏病（ＭＤ）的病原，是第一个能用实验证明具有致肿瘤作用的疱疹病毒，也是研究病毒性肿瘤特别是疱疹病毒肿瘤的理想的实验模型。ＭＤ还是第一个广泛使用疫苗预防的肿瘤性病毒病。应用免疫扩散...

马立克氏病病毒囊膜糖蛋白B抗原Ⅰ型特异性和群共同性决定簇的单克隆抗体

用能表达马立克氏病病毒（ＭＤＶ）糖蛋白Ｂ（ｇＢ）的重组杆状病毒感染的Ｓｆ９细胞免疫小鼠，制备针对ＭＤＶｇＢ的单克隆抗体。以Ⅰ型马立克氏病病毒ＧＡ株感染的鸡胚成纤维细胞作为检测抗原，同时以免疫荧光试验（ＩＦＡ）和酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）来筛选杂交瘤细胞，结果获得了ＩＦＡ和ＥＬＩＳＡ均为阳性的２株单克隆抗体细胞株，定名为ＢＡ４和ＢＤ８。在ＩＦＡ和免疫沉淀试验中，单抗ＢＤ８与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型ＭＤＶ均呈阳性反应；单抗ＢＡ４只对Ⅰ型ＭＤＶ（包括ＣＶＩ９８８疫苗株）呈阳性反应。免疫沉淀反应进一步确证２株单抗识别的是ＭＤＶ糖蛋白Ｂ抗原。

鸭瘟病毒gB蛋白N端主要抗原域的表达及间接ELISA检测

在分析鸭瘟病毒gB蛋白抗原性的基础上,设计一对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因。将克隆的基因定向插入pET-32a的EcoRⅠ和HindⅢ之间,构建了gB蛋白主要抗原域原核表达载体pET-gB1。将pET-gB1质粒转化BL(21)宿主菌后,对培养和表达条件进行了优化,实现了DPVgB蛋白主要抗原域的高效表达。免疫印迹试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性。应用His·Bind亲和层析柱纯化重组DPVgB蛋白,以纯化的重组gB1蛋白作为检测抗原,初步建立了检测鸭瘟病毒抗体的igB1-ELISA。结果表明,抗原的最佳包被浓度为6.5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:待检血清OD490>0.4,且待检血清OD490/阴性血清OD490>2。应用igB1-ELISA对鸭血清样品进行检测,结果表明igB1-ELISA与全病毒包被的iDPV-ELISA符合率达到95.6%。

含有马立克氏病病毒糖蛋白B基因重组质粒的构建及其鉴定

将马立克氏病病毒(MDV)GA 株基因文库中 BamH I I_3和 K_3克隆片段分别用 BamH I 加 Sal I 和 BamH I加 EcoR I 双酶切消化。含有编码 MDV 糖蛋白 B(gB)部分 DNA 的2.B kb、BamH I-Sal I 片段和1.1kb、BamH I-EcoR I 片段与 Sal I-EcoR I 消化的载体 pUR 222通过三聚体连接方式相连接。限制性核酸内切酶分析表明,重组质粒含有 MDV gB 基因,并且 MDV GA 株 gB 基因克隆在 EcoR I,Hind,Ⅲ,Xba I 和 Sal I 切点与 MDVRBIB 株相同。

慢性乙型肝炎患者血清HBV外膜大蛋白、HBsAg、HBV DNA及ALT水平与肝组织炎症活动度的相关性

目的探讨慢性乙型肝炎（CHB）患者血清乙型肝炎病毒外膜大蛋白（LHB）、HBs Ag、HBV DNA和ALT与肝组织炎症程度间的关系。方法选择2011年1月-2014年12月于泰州市人民医院就诊并经肝活组织检查的102例HBe Ag阳性CHB患者,依据肝组织炎症程度,分为轻度炎症组（G0~1）和明显炎症组（G2~4）。计量资料两组间比较采用t检验,多组间比较采用方差分析,采用Spearman等级相关分析比较LHB、HBs Ag、HBV DNA及ALT水平与肝组织炎症分级的相关性,用受试者工作特征曲线下面积（AUC）评估其诊断价值。结果 LHB随HBV DNA水平的升高呈上升趋势;LHB、HBs Ag、ALT和HBV DNA水平诊断明显肝组织炎症的AUC分别为0.763、0.756、0.702、0.581,LHB、HBs Ag、ALT的诊断效能更是达到了中度（AUC：0.70~0.90）,且LHB、HBs Ag对明显炎症的诊断价值优于血清ALT水平。LHB以24.6分作为诊断明显肝组织炎症临界值,诊断明显肝组织炎症的敏感度、特异度分别达到73.4%、60.3%。结论血清LHB、HBs Ag对HBe Ag阳性CHB患者肝组织明显炎症有一定的预测价值。

马立克氏病病毒gB基因的克隆及重组鸡痘病毒的构建

通过PCR方法扩增了马立克氏病病毒 (MDV) 2 .8kbgB基因 ,并且在其两端加上PstⅠ和NotⅠ酶切位点。然后用PstⅠ /NotⅠ酶切回收 gB片段 ,插入到转移载体 pEFgpt12s复合启动子Spromoter的下游的PstⅠ /NotⅠ酶切位点处 ,构建了转移质粒pEFgpt12s gB。将该质粒与鸡痘病毒 (FPV)野毒 2 82E4株共转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,通过MXHAT选择培养基进行筛选 ,蚀斑纯化 ,经PCR扩增证实重组病毒中含有 gB基因。重组病毒和FPV野毒在CEF上形成空斑大小无明显差别 ,病毒效价分别为 10 -5.43 TCID50 /mL和 10 -6TCID50 /mL 。

马立克氏病病毒(MDV)糖蛋白gB在重组鸡痘病毒中的表达

将马立克氏病病毒gB基因用EcoRⅠ从质粒pUR MDVEgB中切下。两端补平后,插入到质粒pEFgpt12s的PstⅠ酶切位点。构建了含有完整的MDVgB基因的转移载体pEFgpt12s gB。这个载体的特点是,它含有两个启动子,在强的复合启动子Spromoter的下游是插入的gB基因,另一个反向启动子vvP7 5的下游是标记基因Ecogpt,它的两端是FPV的非必需区。携带gB基因的质粒pEFgpt12s gB通过磷酸钙的方法转染用282E4株FPV感染3 4h的鸡胚成纤维细胞。通过药物筛选,得到含有gB基因的重组病毒。通过PCR、免疫荧光检测,证实了重组病毒中含有gB基因,并且gB糖蛋白也得到了表达。

鲤春病毒血症病毒Shlj1株糖蛋白空间结构及其B细胞抗原表位的预测

为预测鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus,SVCV)Shlj1株糖蛋白(Glycoprotein,G)的空间结构及B细胞抗原表位,采用RT-PCR法从接种SVCV的鲤上皮细胞悬液提取的病毒总RNA中扩增糖蛋白基因,并通过序列测定获得Shlj1株糖蛋白基因的核苷酸序列及氨基酸序列,利用Phyre2对Shlj1分离株的糖蛋白空间结构进行预测,使用DNAStar软件综合分析糖蛋白的柔性区域、亲水性、表面可能性和抗原指数参数。结果表明:获得的SVCV Shlj1株糖蛋白核苷酸序列长1527 bp,推导出其氨基酸序列为509aa;空间结构预测显示,SVCV Shlj1株糖蛋白存在一定数量的α-螺旋、β-折叠、β-转角及大量无规则卷曲结构,空间构象较规则;抗原指数及抗原表位指数分析显示,糖蛋白中存在许多抗原指数较高的区域,该区域平均抗原指数为1.025,最大值达1.250,其中5个区域(4~26、145~157、293~302、315~327、407~491氨基酸区段)可能是B细胞抗原表位的主要分布区域。本研究结果为SVCV糖蛋白表位疫苗的设计及单克隆抗体的制备奠定了理论基础。

马立克氏病病毒糖蛋白B基因克隆及其在家蚕细胞中的表达

将马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＧＡ株基因文库中的ＢａｍＨＩＩ３和Ｋ３克隆质粒分别用双酶切消化，获得２．８ｋｂ的ＢａｍＨＩ－ＳａｌⅠ片段和１．１ｋｂ的ＢａｍＨＩ－ＥｃｏＲＩ片段，然后将这２个片段定向克隆于载体ｐＵＲ２２２中，构建了含ＭＤＶ糖蛋白Ｂ（ｇＢ）基因的重组质粒。为了基因操作方便和高效表达，设计了１对带有酶切位点的引物，用ＰＣＲ扩增了ＭＤＶｇＢ基因部分片段，并按正确方向插入去磷酸化的载体质粒中，得到起始密码子前带有ＥｃｏＲＩ酶切位点的ＭＤＶｇＢ基因克隆，再将该基因插入去磷酸化的家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）转移载体ｐＢＦ１４中，ＤＮＡ序列分析确证了克隆基因及阅读柜架的正确性。以重组转移载体与野生型ＢｍＮＰＶ共转染家蚕细胞，用有限稀释法点杂交结合空斑技术纯化重组病毒。用荧光抗体试验检查重组病毒感染的家蚕细胞。

马立克病病毒糖蛋白B抗原基因克隆的酶切分析

用狄可辛标记的马立克病病毒(MDV)基因组DNA的BamHⅠ-K_3片断为探针,从建于pUC18质粒中的GA株MDV感染细胞基因组DNA的基因文库中,筛选到MDV糖蛋白B抗原基因克隆,酶切分析表明,GA株MDV的B抗原基因克隆在EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ及BamHⅠ等酶切位点的分布上与RBIB株MDV的B抗原基因没有区别。

抗幽门螺杆菌单克隆抗体与人血小板交叉识别的实验研究

目的:研究抗幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B(ureB)单克隆抗体与血小板膜糖蛋白(GP)的结合情况。方法:运用Western blot、流式细胞术(FCM)和免疫放射法(IRMA)分析血小板膜GP成分与幽门螺杆菌ureB成分的相关性。结果:抗幽门螺杆菌ureB单抗1F11与血小板成分GPⅢa、P-选择素有一定程度结合,但与GPⅠb、GPⅡb及GPⅥ无结合。结论:血小板成分GPⅢa、P-选择素与幽门螺杆菌ureB存在交叉识别的共同抗原表位,提示Hp感染与部分特发性血小板减少性紫癜(ITP)的发病机理有关。

恩替卡韦联合聚乙二醇干扰素α2a治疗乙型病毒性肝炎的效果及对患者血清YKL-40、CEA水平的影响

目的探讨恩替卡韦联合聚乙二醇干扰素α2a治疗乙型病毒性肝炎的效果及对患者血清人软骨糖蛋白-39(YKL-40)、癌胚抗原(CEA)水平的影响。方法选取2016年5月至2017年4宜宾市第二人民医院传染一科收治的慢性乙型病毒性肝炎患者82例,采用随机数表法分为对照组和观察组,每组41例,对照组患者予以聚乙二醇干扰素α2a治疗,观察组患者在此基础上加用恩替卡韦治疗,两组均连续治疗12个月。比较两组患者的临床疗效、HBVDNA转阴情况和并发症发生率,以及治疗前后两组患者的血清YKL-40、CEA、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及肝功能水平。结果观察组患者的治疗总有效率为95.13%,明显高于对照组的56.10%,差异具有统计学意义(P<0.05);治疗后,观察组和对照组患者的血清YKL-40[(26.62±19.51)ng/mLvs(36.55±20.61)ng/mL]、CEA[(1.13±0.07)μg/Lvs(1.20±0.09)μg/L]、TNF-α[(59.18±7.38)ng/Lvs(80.37±10.06)ng/L]、ALT[(60.07±8.38)U/Lvs(72.48±9.08)U/L]、AST[(52.09±6.48)U/Lvs(73.28±9.19)U/L]水平比较,观察组均明显低于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05);治疗后,观察组患者的HBVDNA转阴率为43.9%,明显高于对照组的4.88%,差异具有统计学意义(P<0.05);两组患者的腹水、肺部感染、自发性腹膜炎、肝性脑病、肝肾综合征及胆囊炎发生率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论恩替卡韦联合聚乙二醇干扰素α2a治疗乙肝可提升治疗效果,同时抑制患者YKL-40、CEA、TNF-α的表达,可能是改善肝功提高患者转阴率的关键所在。

β2糖蛋白I与乙型肝炎表面抗原的结合作用

目的:探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者血清与β2糖蛋白I(β2-GPI)结合的影响因素.方法:利用125I标记rHBsAg和β2-GPI,通过液相放射免疫法分别测定血浆中β2-GPI、大肠杆菌M15表达的rβ2-GPI与125I-HBsAg的结合常数(Ka).选取23例血清,其中CHB HBeAg阳性组9例,CHB HBeAg阴性组9例,正常对照组5例,测定其与125I-β2-GPI的结合率.结果:血浆β2-GPI组和rβ2-GPI组的Ka值分别为(2.795±1.846)×108L/mol、(3.001±1.049)×108L/mol.利用嵌套实验设计分析,两组来源不同的β2-GPI的结合常数(Ka1、Ka2)无统计学差异.HBeAg阳性组与阴性组的结合率具有统计学差异(33.200%±11.960%vs54.540%±9.990%,P<0.05).并发现HBeAg阳性组内的不同水平ALT的结合率有差异(42.392%±6.860%vs21.720%±1.442%,P<0.05).结论:血浆中HBsAg与β2-GPI可能有较强的亲和力,β2-GPI的糖基化结构对二者结合作用无影响.HBeAg、ALT影响HBsAg与β2-GPI的结合.

狂犬病病毒糖蛋白表达及纯化及其记忆性B细胞结合能力的分析

表达纯化不同标签、不同大小3个狂犬病病毒糖蛋白,分析其结合功能后,得到具备高亲和力的、可特异性结合记忆性B细胞的狂犬病病毒糖蛋白。本实验通过基因工程的方法,采用不同的原核表达系统分别表达带有不同标签的、全长和膜外区的RVG,纯化蛋白并分析比较其结合功能,荧光标记候选蛋白,结合CD19及CD27的抗体,流式细胞术检测狂犬疫苗免疫后PBMCs中抗狂犬病病毒特异性记忆性B细胞的情况,确认候选蛋白与抗狂犬病毒特异性记忆性B细胞的结合功能。本实验成功构建了3个表达载体pGEX-5X-1-RVG、pET28a-RVG和pET30a-G,优化表达纯化条件成功获得了糖蛋白GST-RVG、His-RVG和His-G。纯化后的GST-RVG、His-RVG和His-G经Western blotting和ELISA鉴定均有抗原特异性;由竞争ELISA法测得3个纯化后糖蛋白与抗狂犬病病毒抗体的亲和力。通过流式细胞术可以检测到狂犬疫苗免疫后阳性志愿者PBMCs中的抗狂犬病病毒特异性记忆性B细胞,从而获得了高亲和力、可用于分选抗原特异性的记忆性B细胞的狂犬病病毒糖蛋白。

单纯疱疹病毒Ⅱ型gE糖蛋白B细胞表位的预测及初步鉴定

目的探讨单纯疱疹病毒II型gE糖蛋白B细胞表位作为靶点研制ELISA试剂盒候选抗原的可能性.方法采用Emini、IEDB等网络在线分析工具对该基因序列的编码区进行表面可及性、柔韧性、抗原表位、亲水性以及线性B细胞表位的生物信息进行综合分析.筛选出不同预测方法中一致的3条多肽,分别以标准阳、阴性血清进行Dot-blot验证,并以临床血清进行ELISA检测效果的评价.结果单纯疱疹病毒II型gE糖蛋白序列具有18个抗原表位和23个线性B细胞表位.Dot-blot检验肽段结果显示,gE糖蛋白B细胞表位具有较强的抗原反应.临床血清检验结果显示,B细胞表位2#和3#多肽均表现出良好的灵敏度和特异性.结论单纯疱疹病毒II型gE糖蛋白B细胞表位多肽可以作为开发抗体诊断用抗原的备选.

β_2糖蛋白I与重组乙型肝炎表面抗原的结合特性

目的 研究 ＨＢｓＡｇ与β２糖蛋白Ｉ（β２ＧＰ Ｉ）的结合特性，探讨 β２ＧＰ Ｉ参与 ＨＢＶ感染的机制。方法 采用酶联免疫吸附实验，研究标记的人β２ＧＰ Ｉ与重组ＨＢｓＡｇ的结合特性。结果 标记的人β２ＧＰ Ｉ与ＨＢｓＡｇ有高度亲和力，并可以被过量的未标记人β２ＧＰ Ｉ所抑制。结论 β２ＧＰ Ｉ与ＨＢｓＡｇ的结合特性可能是β２ＧＰ Ｉ介导乙肝病毒感染肝细胞的结构基础。

β_2糖蛋白Ⅰ与乙型肝炎病毒嗜肝性的关系

目的研究乙型肝炎表面抗原(HBsAg)与β_2糖蛋白Ⅰ(β_2GPⅠ)的结合特性,探讨β_2GPⅠ在乙型肝炎病毒(HBV)嗜肝性中的作用。方法采用Western blot技术,研究还原型与非还原型β_2GPⅠ与HBsAg的结合特性。结果还原型与非还原型β_2GPⅠ与HBsAg有相同的亲和力,推测β_2GPⅠ与HBsAg的结合部位是在一级结构上相邻的氨基酸残基肽段,与空间构象关系不大。结论HBV与β_2GPⅠ有特异的亲和能力,这一亲和能力可能在HBV感染肝细胞过程中发挥了重要作用,是HBV嗜肝性的原因之一。

呈现埃博拉病毒包膜糖蛋白抗原表位重组病毒样颗粒的构建

目的构建呈现埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)包膜糖蛋白(glycoprotein,GP)抗原表位的病毒样颗粒(viruslike particles,VLPs)。方法通过EBOV GP抗原性预测,并结合其功能结构域分析获得潜在的B细胞表位,经基因重组将该抗原表位插入至乙肝核心抗原(HBcAg)的优势表位区域,SDS-PAGE法分析重组HBcAg抗原表位嵌合蛋白的表达。重组菌体破碎上清经硫酸铵沉淀和蔗糖密度梯度离心纯化后,通过电镜观察VLPs形态。将VLPs与Alum佐剂按1∶1的比例混合,经背部皮下免疫小鼠。ELISA及Western blot法检测小鼠血清的特异性。结果重组HBcAg抗原表位嵌合蛋白的相对分子质量约19 300,纯化后蛋白浓度为1.244 mg/ml,镜下可见其以VLPs形式存在。VLPs免疫小鼠血清可与GP发生特异性免疫反应。结论成功构建了呈现EBOV GP抗原表位的VLPs,其可有效诱导小鼠产生特异性免疫应答。本实验为EBOV基因重组疫苗的研究及特异性抗体的制备奠定了基础。