我国猪瘟病毒兔化弱毒株囊膜糖蛋白E0基因的克隆及序列测定

采用异硫氰酸胍一步法从４８０代猪瘟病毒兔化弱毒株（ＨＣＬＶ）脾毒中提取总ＲＮＡ，以该ＲＮＡ为模板，进行反转录，然后采用套式ＰＣＲ扩增出ＨＣＬＶ的囊膜糖蛋白Ｅ０基因，琼脂糖凝胶电泳表明其大小与预计相符。将扩增出的Ｅ０基因克隆到ｐＧＥＭＴ载体中，用自动序列分析仪对其进行序列测定。将测得的序列及推导的氨基酸序列与国外测得的Ｃ株相应序列进行比较，结果发现，它们之间核苷酸序列同源性为９９．０８％，氨基酸序列同源性为９８．４２％。

表达猪瘟兔化疫苗株E0蛋白的PK-15细胞系构建

将克隆到pGEM T-easy载体中的E0基因双酶切回收后,连接到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)中,利用Lipofectami-neTM2000将重组子转染PK-15、BHK-21、VERO 3种细胞,直接在荧光显微镜下用蓝光激发进行观察,在3种细胞中都可以观察到绿色荧光,而且在转染后的24、48、72 h 3个时间点上,观察到的荧光细胞数量逐渐增多,在72 h时荧光细胞的数量在3种细胞中都达到最多,总的来看,在PK-15中荧光细胞的数量最多。通过对细胞荧光的定位发现,重组质粒的荧光主要分布在胞浆内,而且细胞核周围的荧光较强,胞核与胞浆的界限明显,尤其是在PK-15细胞和VERO细胞中这种现象尤为明显。未携带E0目的DNA的pEGFP-N1 Vector转染3种细胞后,都可以观察到绿色荧光,但是整个细胞中是均匀出现荧光的。经酶切、PCR、单抗间接免疫荧光检测,PK-E0细胞中有大量的HCLV的E0表达,单纯的PK-15细胞中没有E0的表达。HCLV株在PK-E0细胞中从48h开始到72h的滴度比在PK-15细胞中的滴度要高。证明PK-E0细胞中E0蛋白的大量表达增加了HCLV在细胞中的复制。

热休克蛋白70促进猪瘟病毒囊膜糖蛋白E0的小鼠免疫效果

为了初步探索热休克蛋白70(Hsp70)作为分子佐剂增强猪瘟病毒亚单位疫苗的免疫效果,本研究根据猪瘟病毒兔化弱毒株囊膜糖蛋白E0的基因序列,设计一对特异性引物,RT-PCR扩增得到完整的E0基因,将其分别插入到原核表达质粒pColdI和含有副猪嗜血杆菌Hsp70的pColdI-Hsp70中,构建了pColdI-E0和pColdI-E0-Hsp70重组质粒,经IPTG诱导表达后,获得了E0、Hsp70和E0-Hsp70融合蛋白。将以上三种蛋白纯化后分组免疫Balb/c小鼠,通过ELISA和流式细胞术测定了小鼠针对E0蛋白的体液免疫和细胞免疫效果。结果显示:E0-Hsp70融合蛋白和E0+Hsp70混合物免疫后均能显著提高抗E0的抗体效价、CD4+和CD8+T细胞水平,并促进IFN-γ的释放。研究结果表明Hsp70能显著增强猪瘟病毒囊膜糖蛋白E0在小鼠上的免疫效果,为在猪体上的进一步应用奠定了基础。