特超强毒648株马立克氏病病毒的囊膜糖蛋白gE基因的克隆和序列比较

鸡马立克氏病毒特超强毒 (vv+MDV) 648株的囊膜糖蛋白 gE基因经PCR扩增并克隆入pUC1 8载体。 648株gE基因经核酸序列分析测定 ,全长为 1 494碱基。所编码的蛋白具有跨膜糖蛋白的一些特征。它含有 8个潜在的糖基化位点、N端有一段疏水区 (1～ 1 9aa)所构成的信号肽、C端有一段疏水区 (391～ 41 9aa)所构成的膜锚着序列。经 648株 (vv+MDV)和马立克氏病毒强毒 (vMDV)GA株的 gE相比较 ,在MDV血清 1型中 gE是较为保守的 ,二者仅有 2个核苷酸的差异 (第 51 2位、第 1 472位 ) ,并导致了有二个相应的氨基酸的改变 (第1 71位Leu/Pro、第 491位Arg/Lys)。

牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白在杆状病毒中的表达及抗原性鉴定

为了获得具有良好抗原性的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组gE蛋白,本研究采用PCR方法扩增全长gE基因,并在其5’端引入蜂素信号肽(HBM)以增加表达蛋白的分泌,将其克隆至pFastBac1供体质粒中,构建重组质粒pFB-gE。将测序正确的p FB-gE转化至DH10Bac感受态细胞中获得重组杆粒(rBacmid-gE),经PCR鉴定后将阳性r Bacmid-gE转染Sf21细胞,获得重组杆状病毒(rBV)。对不同代次的rBV进行PCR鉴定,结果表明获得了整合gE基因的r BV,且能稳定传代。间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,接种rBV的Sf21细胞与gE抗体阳性牛血清反应后出现绿色荧光,而与阴性牛血清不反应,表明g E基因在rBV中获得正确表达。大量培养rBV,收获培养上清液,对重组gE蛋白(rgE)纯化,纯化后的rgE浓度为0.78 mg/mL。对纯化后的rgE进行western blot检测,结果显示,rgE能与g E抗体阳性兔血清和羊血清反应,与IBRV-56(g E基因缺失株)免疫兔血清和健康羊血清均不反应,表明rgE具有较强的反应原性。采用rgE对4只小鼠进行两次免疫,通过间接ELISA方法检测小鼠血清抗体,结果显示,rgE可诱导小鼠产生特异性抗体,表明rgE具有良好免疫原性。本研究为IBRV gE蛋白结构和功能的研究奠定了一定基础,为gE基因缺失疫苗免疫牛与自然感染牛的鉴别诊断提供了物质基础。

基于CRISPR/Cas9技术快速构建PRV gE基因缺失病毒

为快速、高效构建伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)糖蛋白E基因(gE)缺失病毒,基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,首先将pSpCas9(BB)-2A-GFP荧光质粒转染至VERO细胞和PK-15细胞,选出转染效率较高的细胞系,同时于http://crispr.mit.edu/网站设计并合成3个高评分的小导向RNA(small guide RNA,sgRNA),通过噬斑形成试验,筛选出高效sgRNA。其次将筛选出的针对PRV gE基因的sgRNA转染于PK-15细胞,然后接种PRV-1病毒,经过5轮噬斑克隆纯化获得PRV-1-ΔgE。结果显示:VERO细胞比PK-15细胞具有更好的转染效果;gE-sgRNA1和gE-sgRNA2可作为针对gE基因的高效sgRNA;获得了1株PRV gE基因缺失291 bp的病毒,将其命名为PRV-1-ΔgE。研究表明,CRISPR/Cas9基因编辑技术可作为一种高效编辑PRV-1缺失病毒基因的方法,同时也为后续快速应对PRV变异株研究提供了新思路。

胃上皮永生细胞、胃腺癌细胞和胃腺癌淋巴结转移细胞多耐药基因1和P-糖蛋白的表达

目的:探讨胃上皮永生细胞、胃腺癌细胞和胃腺癌淋巴结转移细胞中多耐药基因1(mdr1)和P糖蛋白(P gp)的表达。方法:常规培养胃上皮永生细胞系(GES-1)、胃腺癌细胞系(BGC823)和胃腺癌淋巴结转移细胞系(SGC7901)细胞,用RT PCR和原位杂交检测此3种细胞的mdr1mRNA表达,用免疫印迹和免疫组化检测它们的P gp表达,用流式细胞仪检测阿霉素在细胞内的蓄积以判断它们的P gp功能状态。结果:在原位杂交的标本上,杂交信号呈紫蓝色颗粒,分布于胞质。GES1细胞颗粒数量少,BGC823颗粒数量多,细胞轮廓十分明显;SGC7901颗粒细小而少,少数细胞杂交信号丰富。免疫印迹显示GES1P gp的表达较BGC823和SGC7901弱;GES1P- gp积分光密度为46.36±19.24,BGC823为61.32±28.46,SGC7901为50.45±21.36,BGC823的P gp表达强于SGC7901和GES1(P<0.05),SGC7901和GES1的差异无统计学意义(P>0.05)。GES1阿霉素特异荧光强度为10.12±4.18,BGC823为27.44±7.06,SGC7901为35.88±14.55,3者相比差异有统计学意义(P<0.001)。结论:在胃癌的发生发展中,细胞对抗肿瘤药的反应性不同,随着细胞恶性变,P gp介导的耐药性增加。

单纯疱疹病毒I型糖蛋白D酵母表达载体的构建

目的:构建含有单纯疱疹病毒I型包膜糖蛋白D全基因片段的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组gD蛋白奠定基础。方法:应用PCR方法从HSV-I基因组中扩增糖蛋白D的全长基因,产物回收后与pMD-18T载体连接,并转化,经氨苄筛选及测序,建立克隆载体pMD18T-gD;克隆载体与表达载体双酶切后,产物连接、转化大肠杆菌JM109,筛选、测序后确定构建了酵母表达载体pGAPZαA-gD。结果:重组质粒pMD18T-gD和pGAPZαA-gD经PCR和酶切均出现相应长度的片段,测序结果证实为gD基因,序列分析同源性为99.66%。结论:成功构建了含有单纯疱疹病毒I型糖蛋白D全基因的克隆载体及酵母表达质粒。

猪伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白E基因的序列结构分析

对猪伪狂犬病毒鲁A株(PRVLA株)gE基因进行了克隆和序列测定。应用DNAStar程序分析了PRV国内外各分离株以及PRV与HSV-1、BHV-1、EHV-1、CHV-1、MDV-1、SHV-SA8、SVV、ILTV的gE基因。PRV各分离株的gE基因有很高的同源性。不同疱疹病毒的gE核苷酸和氨基酸的同源性很低,但具有相似的结构。对上述α疱疹病毒的gE氨基酸序列进化树分析可以将其分为四个特定的组:单纯疱疹病毒组,水痘疱疹病毒组,类马立克氏病病毒组,传染性喉气管炎病毒组,推测α疱疹病毒的gE基因在进化上可能起源于ILTV的gE基因的或其前体基因。而且gE基因的进化趋势与其宿主的进化情况一致。

7例水痘患者水痘带状疱疹病毒的分离与鉴定分析

目的对7例临床水痘患者的疱疹液样本,进行水痘带状疱疹病毒(varicella-herpes zoster virus,VZV)的分离及鉴定分析。方法对7例临床水痘患者的疱疹液,用2BS细胞进行病毒分离及病毒滴度检测;用特异性引物分别对病毒分离株及疫苗株(Oka株)的ORF68、ORF54、ORF38进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增及测序,用DNAMAN软件对病毒分离株的ORF68序列与Dumas株序列进行比对鉴定,并对病毒分离株和Oka株的ORF54、ORF38进行限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析。结果从7例临床水痘患者的疱疹液样本中,分离到4株VZV病毒株;病毒分离株的细胞病变(cytopathic effect,CPE)及病毒滴度随传代次数的增加而增强;4株病毒分离株的ORF68序列与Dumas株完全一致;ORF54、ORF38的RFLP结果显示,4株病毒分离株均为BglⅠ+PstⅠ+型,Oka株为BglⅠ+PstⅠ-型。结论成功分离的4株病毒分离株均为VZV野生毒株。

红细胞血型Gerbich抗原研究进展

Gerbich抗原是重要的红细胞血型系统抗原,抗原的系统命名是:GE,系统编号020。2019年国际输血协会(ISBT)确认该系统有11个抗原,其中高频抗原6个,低频抗原5个。Gerbich抗原的名称取自先证者格尔比奇女士的名字,她的GE抗原表型为Ge:-2,-3,4,此表型被称为Gerbich表型。GE抗原与MNS抗原都属于血型糖蛋白(GP)类抗原。MNS抗原表达在GPA、GPB和GPE上,GE抗原表达在GPC、GPD上。

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白gE在昆虫细胞中的表达鉴定及其晶体培养

目的利用杆状病毒-昆虫表达系统建立纯化水痘带状疱疹病毒(VZV)包膜糖蛋白gE的方法,筛选gE蛋白的晶体培养条件,以期用于结构解析。方法将VZV糖蛋白gE基因序列克隆至杆状表达载体pAcgp67B载体中,利用High FiveTM昆虫细胞表达gE蛋白并进行TALON亲和层析纯化;利用WAVE生物波浪反应器建立含硒代甲硫氨酸的gE蛋白方法,以便在晶体结构解析中利用单波长或多波长异常散射进行相位解析;通过分子排阻色谱、分析超离,差示扫描量热法和酶联免疫吸附试验等分析gE蛋白的理化性质;利用结晶试剂盒对gE498和gE354蛋白的结晶条件进行初筛。结果获得的gE498和gE354蛋白纯度约为90%、产量为8~10 mg/L。理化分析显示两种gE蛋白在溶液中主要以均一稳定的单体形式存在,并呈现出良好的反应原性。在gE354晶体初筛中获得3个结晶条件:CrystalH3、PEGH12和IndexB10。结论建立了VZV糖蛋白gE表达和纯化方法,制备的蛋白纯度高,且具有反应原性,并筛选出CrystalH3、PEGH12和IndexB10这3个结晶条件,为gE糖蛋白的结构与功能研究及新型疫苗开发奠定了基础。

单纯疱疹病毒Ⅱ型gE糖蛋白B细胞表位的预测及初步鉴定

目的探讨单纯疱疹病毒II型gE糖蛋白B细胞表位作为靶点研制ELISA试剂盒候选抗原的可能性.方法采用Emini、IEDB等网络在线分析工具对该基因序列的编码区进行表面可及性、柔韧性、抗原表位、亲水性以及线性B细胞表位的生物信息进行综合分析.筛选出不同预测方法中一致的3条多肽,分别以标准阳、阴性血清进行Dot-blot验证,并以临床血清进行ELISA检测效果的评价.结果单纯疱疹病毒II型gE糖蛋白序列具有18个抗原表位和23个线性B细胞表位.Dot-blot检验肽段结果显示,gE糖蛋白B细胞表位具有较强的抗原反应.临床血清检验结果显示,B细胞表位2#和3#多肽均表现出良好的灵敏度和特异性.结论单纯疱疹病毒II型gE糖蛋白B细胞表位多肽可以作为开发抗体诊断用抗原的备选.

水痘-带状疱疹病毒高效价中和抗体的制备及应用

目的制备水痘-带状疱疹病毒(varicella-herpes zoster virus,VZV)高效价特异性免疫血清,用于水痘减毒活疫苗及带状疱疹减毒活疫苗质量控制。方法将高纯度重组gE糖蛋白分别与弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂及MF59佐剂组合,免疫雄性家兔,每组2只,免疫后第56天,每只最大量采血(心脏或颈动脉)制备血清,与VZV混合进行中和反应后,接种至长满单层MRC-5株人二倍体细胞的6孔板中,孵育7 d,计数空斑数,检测免疫血清的中和效价和中和病毒能力;选择高中和效价和高中和病毒能力血清进行水痘减毒活疫苗及带状疱疹减毒活疫苗VZV(Oka株)工作种子批毒种鉴别试验和外源病毒因子检查。结果重组gE糖蛋白的多种组合免疫家兔后制备的免疫血清均具有中和活性,其中重组gE糖蛋白与弗氏佐剂组合免疫后制备的血清中和效价最高,为1:512,中和病毒能力可达240000 PFU/mL;制备的免疫血清用于VZV(Oka株)工作种子批毒种鉴别试验和外源病毒因子检查,结果均符合要求。结论重组gE糖蛋白可用于VZV高效价中和抗体制备,制备的高效价中和抗体适用于水痘减毒活疫苗及带状疱疹减毒活疫苗质量控制。

脓毒症患者血小板参数与Toll样受体4表达的关系及中西医结合治疗研究

目的观察西药联合加味凉膈散对脓毒症患者血小板参数变化及活化状态与血小板Toll样受体4（TLR4）表达、炎症反应变化的影响。方法64例脓毒症患者依据“不平衡指数最小的分配原则”随机分为西医常规治疗组（X组，32例）和西医联合加味凉隔散组（L组，32例），比较两组患者人院时及治疗3、5、9d的血小板计数（PLT）、平均血小板体积（MPV）、血小板分布宽度（PDW）、血小板TLR4阳性表达率、血小板膜糖蛋白GPⅡb／Ⅲa的半胱天冬酶原活化复合物-1（PAC-1）表位阳性表达率及血浆可溶性CD40配体（sCD40L）、肿瘤坏死因子-α（TNF—α）浓度变化，以及急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ（APACHEⅡ）评分、重症监护病房（ICU）住院时间、出血事件及28d病死率。以同期15例健康体检者作为对照组（C组）。结果与C组比较，脓毒症患者PLT（×10^9／L）显著降低（211．37±77．84比272．33±34．23，P〈0．01），MPV（fL）、PDW（fL）均显著增大（MPV：10．24±0．81比9．64±0．66；PDW：17．79±1．68比15．61±1．54，P〈0．05和P〈0．01），伴有血小板TLR4及PAC-1表达上调[TLR4：（39．93±9．07）％比（23．50±4．68）％，PAC-1：（42．21±8．74）％比（21．02±3．49）oA，均P〈0．01]，血浆中sCD40L（μg／L）和TNF—α（ng／L）浓度显著上升（sCD40L：6．94±1．05比3．27±0．41；TNF—α：60．10±9．77比4．08±3．08，均P〈0．01）。治疗后9d，L组肝肾功能、TLR4和PAC-1表达及血浆sCD40L、TNF—α浓度较X组显著降低（肌酐（μmol／L）：106．2±34．4比127．5±43．7；丙氨酸转氨酶（U／L）：31．7±12．5比41．9±19．9；天冬氨酸转氨酶（U／L）：54．1±21．6比68．5±24．1；TLR4：（27．14±6．08）％比（30．92±5．47）％；PAC-1：（9,7．52±6．51）％比（31．24±5．77）％；sCD40L：3．86±0．69比4．38±0．73；TNF—α：22．06±7．19比28．25土8．99，P〈0．05或P〈0．01]，PLT（×10。／L）较X组显著升高（261．93±55．32比231．37±63．58，P〈0．05）。相关性分析显示：脓毒症患者血小板PAC-1表达与PLT呈负相关（r=-0．409，P〈0．01），与MPV、PDW、血小板TLR4表达、血浆sCD40L水平呈正相关（r1=0．262，r2=0．318，r3=0．341，r4=0．519，均P〈0．01）；sCD40L与TNF—α呈正相关（r=0．542，P〈0．01）。L组ICU住院时间（d）明显短于X组（8．06±2．86比9．31士2．48，P〈0．05），出血发生率低于X组（12．5％比21．9％，P〈0．05），9dAPACHEⅡ评分（分）显著低于X组（12．75±4．56比14．59±3．97，P〈0．05）。L组与X组28d病死率差异无统计学意义（15．63％比18．75％，P〉0．05）。结论脓毒症炎症反应常伴有血小板TLR4表达上调、血小板活化及PLT减少；西医联合加味凉膈散可通过下调血小板TLR4表达、减少血小板活化及炎症介质的释放，从而改善脓毒症患者血小板减少状态。

水痘带状疱疹病毒重组腺病毒载体疫苗的构建及评价

目的构建表达水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)gE抗原的重组腺病毒载体疫苗,并对其免疫原性进行评价。方法采用AdEasy系统构建携带gE基因的重组腺病毒质粒pAdEasy-gE,PCR及Western blot法鉴定AD293细胞系包装的重组腺病毒rAd-gE,采用阴离子和复合介质Capto Core 700两步法对其进行纯化。以3. 3×10~6、1×10~7、3×10~7ifu剂量的rAd-gE分别单针肌内注射免疫NIH小鼠,检测小鼠血清抗体滴度。结果 PCR及PacⅠ酶切鉴定表明,携带gE基因的pAdEasy-gE构建成功;PCR及Western blot分析显示,AD293细胞系成功包装可表达gE糖蛋白的rAd-gE;经两步法纯化,可回收18. 2%的rAd-gE。1×10~7和3×10~7 ifu剂量的rAd-gE可引起小鼠的体液免疫响应。结论已成功构建表达高度糖基化gE糖蛋白的rAd-gE,可有效引起小鼠的体液免疫响应,为VZV新型重组腺病毒疫苗的进一步研发奠定基础。

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E胞外区的真核表达及鉴定

目的真核表达水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)糖蛋白E胞外区(gE_(537)),并进行鉴定。方法用Oka株VZV(VZV-Oka)感染人二倍体细胞(2BS株),提取基因组DNA,以其为模板,PCR扩增gE_(537)目的片段,克隆至载体pCI-neo,构建重组真核表达质粒p CI-neo-g E_(537)-His。大量扩增后提取质粒,转染293FT细胞,瞬时表达,经镍柱纯化,获得目的蛋白gE_(537)-His,Western blot和ELISA法进行鉴定。结果经双酶切及测序鉴定,重组真核表达质粒pCIneo-g E_(537)-His构建成功。200 mmol/L咪唑洗脱液为洗脱目的蛋白的最佳咪唑浓度。纯化产物可与鼠抗gE糖蛋白单抗于相对分子质量约90 000处发生特异性结合,且可与mAb-10、mAb-12抗gE单抗发生反应。结论利用293FT细胞成功表达了gE_(537),为其免疫原性等相关研究奠定了基础。

急性心肌梗死与纤维蛋白原和血小板膜糖蛋白基因多态性关系

目的探讨急性心肌梗死（AMI）患者B纤维蛋白原（Fg）-455A基因多态性、血小板膜糖蛋白（GP）Ia807T基因多态性与AMI发病的关系。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR—RFLP）方法检测120例AMI及120例正常人的βFg-455G／A和GP1a807C／T基因型。结果在安徽地区汉族人群中，AMI组βFg-455A等位基因频率显著高于对照组（X^2=5．91，P〈0.05），AMI组GPIa807T等位基因频率显著高于对照组（X^2=7．33，P〈0．01）。结论在安徽汉族人中，BFg-455A与GPIa807T等位基因可能是AMI患者的遗传危险因素。

超声截留灌流培养重组CHO细胞工艺优化

目的采用超声截留控制器超声使得细胞聚集、沉降的方法截留悬浮细胞,优化重组CHO细胞灌流培养工艺。方法基于无血清化学限定(CD)培养基,选择表达水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)糖蛋白E(VZV gE)的重组CHO细胞在5 L生物反应器中灌流培养。对初步确定的培养条件进行响应面分析,优化培养温度、培养基pH、灌流速度;并采用上述优化条件验证超声截留控制器灌流培养重组CHO细胞工艺。结果本实验条件下,优化后的灌流培养条件为:温度33.2℃、pH 7.0、灌流速度4.1 mL/min。3批验证结果显示,相较批培养,灌流培养时间延长5~7 d,收获体积增加5~7倍。其中,葡萄糖和乳酸含量、细胞密度和活性批间变化趋势一致;细胞截留效率均高于90%,批间差异无统计学意义(P>0.05);目的蛋白比活性约为0.5,批间差异无统计学意义(P>0.05);Western blot结果显示,相对分子质量和糖基化修饰与批培养一致。结论实现了5 L生物反应器灌流培养重组CHO细胞表达gE蛋白工艺,为后续大规模生产提供了依据。