松口蘑发酵菌丝体糖蛋白MTS03对人乳腺癌细胞MCF-7的体外增殖抑制作用研究

目的研究松口蘑发酵菌丝体糖蛋白MTS03的理化性质及抗肿瘤作用。方法采用SDS-PAGE鉴定MTS03的纯度及相对分子质量,氨基酸自动分析仪分析其中的氨基酸组成;MTT法研究糖蛋白MTS03体外对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制率,同时考察MTS03对人正常肝细胞L-02的杀伤率,评价其安全性。结果SDS-PAGE电泳鉴定为单一组分,测定其相对分子质量约为2.37×10~4,经氨基酸自动分析仪分析含有17种氨基酸;MTS03对MCF-7具有直接的细胞毒作用,在一定的浓度范围内呈现量效和时效关系,MTS03对MCF-7作用24,48,72h的IC_(50)分别为25.81,12.46,8.86mg·L^(-1),而对正常肝细胞的IC_(50)分别为1366.49,190.60,95.58mg·L^(-1),对MCF-7的治疗指数TI分别为54.16,18.74,12.25。结论MTS03对于体外培养的乳腺癌细胞具有良好的直接杀伤作用,而对正常肝细胞的毒性较小,可能是一种高效低毒的生物活性物质。

苯并噻二唑(BTH)对苹果抗斑点落叶病的诱导

对诱导剂苯并噻二唑(Benzothiadiazole,BTH)在不同质量浓度下对苹果抗斑点落叶病的诱导作用,以及诱导抗性与木质素和富含羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)含量的关系进行了研究。BTH诱导苹果主枝顶梢,整株接菌后,采用病情指数统计发病程度。培养基测定抑菌活性;比色法测定苹果受诱导后木质素和HRGP含量。结果表明,BTH能诱导苹果产生系统获得性抗性,当诱导质量浓度为150mg/L时,可使病情指数由对照的26.34下降到16.87,抗病持效期可达15d,而BTH本身对苹果斑点落叶病菌分生孢子萌发及菌丝生长无明显影响。生理指标测定表明,木质素和富含羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)含量增加,可能是抗病性增强的生理原因。

消化道肿瘤MDR1基因和P-糖蛋白的表达与化疗药物耐药的关系

目的探讨消化道肿瘤多药耐药基因MDR1基因和P-糖蛋白(P-gp)的表达与肿瘤化疗药物耐药之间的关系。方法选择72例消化道肿瘤患者的手术标本,采用荧光定量PCR检测MDR1 mRNA表达量,ELISA法检测P-gp表达水平,并与ATP-TCA化疗药物敏感性试验结果作对照。结果 72份消化道肿瘤组织中,MDR1 mRNA阳性表达率为75%,P-gp阳性表达率为67%。72份消化道肿瘤组织中,对10种化疗药物均不敏感的有12份,对1种化疗药物敏感的有15份,对2种化疗药物敏感的9份,对3种化疗药物敏感的有9份,对5种化疗药物敏感的有15份,对8种化疗药物敏感的有9份,对所有化疗药物均敏感的有3份。消化道肿瘤MDR1mRNA、P-gp的阳性表达率与其对化疗药物敏感程度呈负相关(r s值分别为-0.672、-0.715,均P<0.05)。结论 MDR1基因、P-gp表达与肿瘤耐药性相关,MDR1基因、P-gp阳性表达提示患者可能对化疗药物存在获得性耐药。

CYP3A5和MDR1基因多态性对阿奇霉素药代动力学的影响

目的:探讨药物代谢酶CYP3A5*3和P-糖蛋白编码基因MDR1 C3435T的基因多态性对中国健康受试者口服阿奇霉素药代动力学的影响。方法:20名中国健康受试者服用单剂量阿奇霉素片500 mg,生物检定法测定血药浓度。特异性等位基因扩增法(PCR-ASA,两步法)和聚合酶链反应结合限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析法分别检测受试者CYP3A5*3和MDR1 C3435T的基因型,按基因型分组比较基因多态性对阿奇霉素药代动力学特性的影响。结果:在20名受试者中,CYP3A5*3:野生型纯合子3名,野生型杂合子10名,突变型纯合子7名;MDR1 C3435T野生型纯合子12名,野生型杂合子和突变型纯合子各4名。将CYP3A5*3的3种基因型中野生型纯合子和野生型杂合子合为一组,与突变型纯合子比较。后者cmax显著高于前者38.14%(P<0.05)。如果去除MDR1 C3435T基因型的影响,则两组cmax差异更大(P<0.01),后者的cmax比前者高51.83%。而两种基因组的AUC0-144变化均没有表现出显著统计学意义。结论:CYP3A5*3和MDR1C3435T基因多态性是影响阿奇霉素药代动力学特性的重要因素。

人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体的表达和鉴定

目的对人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体A12进行可溶性表达及特异性和中和活性检测。方法表达人源单链抗体A12的菌株,经诱导后进行SDS-PAGE及Western blot检测,用流式细胞仪(FACS)检测表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染Vero细胞的能力,用快速荧光灶抑制实验(RFFIT)检测表达产物的中和活性。结果Western blot显示表达产物与抗C-myc抗体在相对分子质量约30 000处出现强阳性表达带。FACS表明A12与表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染的Vero细胞出现特异性反应。RFFIT表明,A12 ScFv在1∶27倍稀释时能完全中和病毒。结论已获得了A12可溶性表达,表达产物能与狂犬病毒G蛋白特异性结合,并对狂犬病毒具有一定的中和活性。

大肠癌组织中P-gp和GST-π及TopoⅡ的表达及其临床意义的研究

目的:探讨多药耐药P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、谷胱甘肽转移酶(glutathione-S-trannsferaseπ,GST-π)和拓扑异构酶(DNA topoisomeraseⅡ,TopoⅡ)在大肠癌组织中的表达及临床意义。方法:应用免疫组化SP法联合检测P-gp、GST-π和TopoⅡ在84例大肠癌组织和20例正常大肠黏膜组织中的表达,并结合临床病理参数进行分析。结果:P-gp、GST-π在大肠癌组织中的表达率分别为71.4%(60/84)和75.0%(63/84),高于正常大肠黏膜组织(8/20和11/20),χ2值分别为6.91和3.14,P均<0.05;P-gp表达强度与临床分期相关,高分期P-gp表达(86.7%、39/45)较低分期(65.5%、19/29)高,χ2=5.28,P<0.05;TopoⅡ在大肠癌组织中的阳性率为45.3%(38/84),低于正常大肠黏膜组织65%(13/20),χ2=0.382,P>0.05;高、中和低分化腺癌P-gp(87.5%、80.7%和54.5%)和GST-π(87.5%、82.5%和54.5%)的表达率由高到低;TopoⅡ的表达率由低到高(37.5%、45.6%和63.6%)。淋巴结转移组P-gp和GST-π的表达显著高于无淋巴结转移组,P<0.05。结论:P-gp、GST-π和TopoⅡ均在大肠癌原发性多药耐药中起重要作用。联合检测P-gp、GST-π和TopoⅡ对于大肠癌化疗方案选择具有一定的指导意义。

Clusterin基因的研究进展

对丛生蛋白(Clusterin,CLU)的结构、功能、调控及生理作用进行综述。Clusterin是1个高度保守的基因,该基因包含9个外显子和8个内含子,分析表明CLU存在3种转录本异构体,能够转录翻译生成几种不同形式的蛋白。其中,分泌型Clusterin(secreted Clusterin,sCLU)是分子量为75～80kDa的糖基化蛋白,它几乎存在于所有的生理体液中,具有细胞保护作用。胞核型Clusterin(nuclear Clusterin,nCLU)由细胞质转移入细胞核中,有促进细胞凋亡的调节作用。体外细胞水平研究结果表明,CLU的表达与TGF-β、IGF-1R/SRC/MAPK/Egr-1、核转录因子NF-κB相关,且受致癌基因的调节。最近通过对鱼类的CLU基因的研究发现CLU在血脑屏障区高度表达,且其表达受到Delta-Notch信号通路的负调控,但不受IGF信号通路的调控。

耐药基因相关蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义

背景与目的肿瘤的多药耐药是肺癌化疗失败和导致患者死亡的重要原因之一。本研究的目的是探讨P糖蛋白(Pgp)、多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药蛋白(LRP)、拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)、谷胱甘肽S转移酶π(GSTπ)在肺癌中的表达及其临床意义。方法采用免疫组织化学染色链亲和素生物素过氧化物酶法(streptavidin-biotin immunoperoxidase,SP)检测98例非小细胞肺癌组织中5种耐药蛋白的表达。结果Pgp、MRP、LRP、TopoⅡ、GSTπ的阳性表达率分别为27.6%、11.2%、75.5%、50.0%和64.3%。LRP、TopoⅡ在鳞癌、腺癌、腺鳞癌间的表达有显著性差异(P<0.05)。5种耐药蛋白的表达与临床分期无明显关系(P>0.05)。47例接受化疗的非小细胞肺癌患者中,Pgp、LRP、GSTπ的表达与化疗疗效有密切关系(P<0.05)。结论肺癌的耐药由多种耐药蛋白介导,联合检测肺癌组织中耐药蛋白的表达有助于选择合理的化疗方案及判断化疗疗效。

肾病综合征患儿血清β_2-糖蛋白I/氧化低密度脂蛋白复合物水平升高的研究

目的在血循环中氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)易与β2-糖蛋白I(β2-glycoproteinI,β2-GPI)结合成稳定的β2-GPI/ox-LDL复合物,该复合物是血栓形成和动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)发生的新的危险因素。原发性小儿肾病综合征(nephritic syndrome,NS)患者伴有高脂血症和高氧化应急状态,具有肾小球硬化和血栓的危险性。文中检测NS患儿血清β2-GPI/ox-LDL复合物水平,分析其与NS病情的关系。方法以抗人β2-GPI抗体为包被抗体,酶标记抗载脂蛋白B(apo B)为检测抗体的血清β2-GPI/ox-LDL ELISA检测法,检测84例NS患儿和84例年龄、性别匹配的健康儿童(对照组)的血清。用ELISA法检测血清ox-LDL浓度,同时检测研究对象常规血脂水平和肾功能指标。结果 NS患儿血清β2-GPI/ox-LDL水平显著高于对照组[(1.08±0.47)U/ml vs(0.54±0.29)U/ml,P<0.001],ox-LDL浓度也明显升高[(143.76±64.55)mg/L vs(89.11±53.80)mg/L,P<0.01]。相关分析显示,β2-GPI/ox-LDL水平与ox-LDL(r=0.721)、LDL-C(r=0.518)、TC(r=0.503)、TG(r=0.380)以及尿蛋白(r=0.326)显著正相关(均为P<0.01),与血清清蛋白(Alb)显著负相关(r=-0.417,P<0.01)。进一步多因素分析显示,NS患儿β2-GPI/ox-LDL复合物水平49.5%的变化由ox-LDL(β=0.527,P<0.01)、尿蛋白(β=0.172,P=0.036)和LDL-C(β=0.203,P=0.037)决定。结论血清β2-GPI/ox-LDL水平升高与NS患儿病情有关。

汉族人血小板GPⅡb HPA-3基因多态性与冠心病的相关性研究

目的:观察血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb人类血小板抗原-3(HPA-3)基因多态性,在北京河北地区汉族人中各基因型的分布频率,分析该多态性与冠心病易感性的相关性。方法:本研究采用病例对照设计,筛选符合冠心病、健康人入选标准的212例冠心病患者及106例健康对照人群为研究对象,记录冠脉造影病变支数,采用TaqMan探针技术检测HPA-3基因多态性。结果:大于45岁的人群中,至少含有1个HPA-3b等位基因者较HPA-3a/3a原生型纯合子,冠心病人(72.4%/27.6%)多于健康人(57.1%/42.9%),不同基因型在冠心病组和健康对照组两组间的分布具有显著差异(P<0.05);冠心病患者不同病变支数基因型构成无显著差异(P>0.05)。以是否患冠心病为因变量的二分类Binary Logistic回归分析,校正年龄、性别、体重指数对冠心病的影响后,结果显示HPA-3多态位点基因型与冠心病发病密切相关,含有至少1个HPA-3b等位基因者较HPA-3a/HPA-3a纯合型发生冠心病的危险性是2.105倍。结论:GPⅡb的HPA-3多态位点是汉族人冠心病发病的独立危险因素,尤其在年龄>45岁的人群中表现明显。

马立克病病毒囊膜糖蛋白E基因的克隆及序列分析

用聚合酶链式反应 (PCR)技术 ,从中国广西分离的马立克氏病病毒 (MDV)N株和G2 株基因组DNA中 ,扩增出MDV糖蛋白E(gE)抗原基因片段的 1 5 0 0bp编码序列。将PCR扩增产物在KpnⅠ和HindⅢ位点克隆进 pUC1 8质粒载体中 ,以Dig标记的gEPCR产物作为探针做斑点杂交及酶切分析筛选到含MDVgE基因的目的重组质粒 pMNE、pMG2 E。通过酶切位点分析显示 ,两毒株的 gE基因内部酶切位点与MDV GA国际标准强毒株的酶切位点基本一致。对重组 pMNE、pMG2 E质粒进行部分序列测定 ,并用DNAStar软件分析 ,结果表明 :插入序列与发表的GA株gE基因序列具有高度同源性 ,gE基因为高度保守基因。

狂犬病病毒糖蛋白膜外区表达及中和抗体间接ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR方法克隆了狂犬病病毒CVS株G蛋白基因编码区,进而将完整编码区和膜外区编码基因分别克隆于pET-32a,将其中含膜外区编码基因的重组质粒pET-32a-PG转化BL21(DE3),经1.0 mmol.L-1IPTG诱导,外源基因获得高效表达。通过Western-blot以及ELISA试验证明表达产物具有良好的反应原性。以纯化后的表达产物作为抗原包被酶标板,用已知中和抗体效价的OIE参考血清对该方法进行了标准化,建立了检测狂犬病病毒中和抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被量为3.74μg,血清的最佳稀释度为1:100,待检血清阳性临界值为0.50。用此方法检测了418份血清样品,并与荧光抗体病毒中和试验(FAVN)方法进行了比较,符合率为98.61%。

有氧运动对老年原发性高血压患者血小板表面糖蛋白受体的影响

目的:探讨规律运动对老年原发性高血压患者血小板表面活化分子标志蛋白及血小板聚集的影响。方法:将我院门诊就诊的老年原发性高血压患者212例随机分为两组,对照组103例,实验组109例,后者在常规治疗的基础上采取中等量的运动疗法3个月。采用流式细胞术(FCM)以单克隆抗体分子作为探针,分别测定两组患者运动前后血小板膜上CD62P、CD61的阳性百分率(CD62P%、CD61%)及血小板聚集率。结果:进行运动疗法3个月后,对照组与实验组两组患者,收缩压分别为160±4.6mmHg及156±4.5mmHg(P<0.05);舒张压分别为92±4.2mmHg及88±2.9mmHg(P<0.01);血小板膜上CD62P阳性百分率分别为17.3%±2.2%及12.5%±3.1%(P<0.01)、CD61阳性百分率分别为20.3%±2.4%及16.2%±2.3%(P<0.01);血小板聚集率分别为:71.4%±4.6%及62.3%±3.4%(P<0.01)。结论:规律运动不仅可以降低老年高血压患者的血压,而且能够降低血小板表面活化受体分子的密度,降低血小板聚集,有利于防止高血压患者的血栓前状态的形成。

急性冠脉综合征患者抗血小板药物疗效和对氯吡格雷的反应性

目的:通过检测血小板受血管舒张剂刺激的磷蛋白磷酸化程度和活化的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体(PAC-1)表达评价急性冠脉综合征患者抗血小板治疗前后血小板活性的变化和对氯吡格雷的反应性。方法:研究对象为正常对照组15例,稳定性心绞痛组20例和急性冠脉综合征组33例。稳定性心绞痛组仅接受阿司匹林抗血小板治疗,急性冠脉综合征组予氯吡格雷、阿司匹林和肝素抗血小板治疗,分别在入选时和冠心病患者抗血小板治疗后第7天用流式细胞术检测PAC-1表达和受血管舒张剂刺激的磷蛋白磷酸化程度并计算血小板反应性指数(PRI)。结果:入选时正常对照组、稳定性心绞痛组和急性冠脉综合征组PAC-1值依次增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。稳定性心绞痛组和急性冠脉综合征组抗血小板治疗7天后较入选时PAC-1显著下降。入选时正常对照组、稳定性心绞痛组和急性冠脉综合征组PRI值组间差异无统计学意义(P>0.05)。抗血小板治疗第7天时稳定性心绞痛组患者PRI无明显变化(P>0.05),急性冠脉综合征组PRI明显下降,差异有统计学意义(P<0.001),但分布较治疗前明显离散(17.8～80.1较65.70～92.10)。急性冠脉综合征组PRI下降与氯吡格雷干预呈正相关(r=0.766,P<0.001)。稳定性心绞痛组抗血小板治疗第7天时有9例(45)患者PAC-1大于入选时均数-2倍标准差。急性冠脉综合征组第7天时有9例(27)患者PRI大于入选时均数-2倍标准差,9例(27)患者PAC-1大于入选时均数-2倍标准差,7例(21)患者同时高于上述值,2例(6)患者PRI大于入选时均数-2倍标准差但PAC-1小于入选时均数-2倍标准差,另有2例患者PRI小于入选时均数-2倍标准差但PAC-1大于入选时均数-2倍标准差。结论:①氯吡格雷联合阿司匹林和肝素治疗能显著抑制急性冠脉综合征患者的血小板活性,但部分患者治疗后血小板活化聚集功能抑制不良,近30患者对氯吡格雷反应低下。②治疗前后联合检测血小板受血管舒张剂刺激的磷蛋白磷酸化程度和PAC-1能评价急性冠脉综合征患者总体抗血小板疗效和对氯吡格雷的反应性。

人类血小板特异性抗原及其与特发性血小板减少性紫癜相关性研究进展

人类血小板特异性抗原(HPA)是表达于不同血小板膜糖蛋白(GP)上的抗原表位,是血小板外膜上特有的抗原决定簇。HPA的种族差异性可导致血小板同种免疫性疾病发生。特发性血小板减少性紫癜(ITP)是一种相当普遍的出血性疾病,目前认为其发病机制与同种免疫反应有关。本文介绍了HPA的命名、定位、分子学生物特征,与之相关的血小板膜糖蛋白,综述了国内外HPA基因多态性与ITP发病相关性研究。

替罗非班在老年人急诊经皮冠状动脉介入治疗中预防无复流的临床观察

目的观察老年人急诊PCI术中冠状动脉内注射替罗非班对术后无复流的影响。方法选择急性心肌梗死行急诊PCI患者163例,随机分为替罗非班组(83例)和对照组(80例)。替罗非班组在导丝通过病变后经导管冠状动脉内注射替罗非班10μg/kg,之后予替罗非班0.15μg/(kg·min)持续静脉滴注24 h。对照组给予常规治疗。观察2组患者TIMI、心肌灌注分级(TMPG),入院后30 d LVEF和左心室舒张末内径,心血管事件及出血并发症。结果替罗非班组TIMI血流3级和TMPG 2～3级比例较对照组明显升高,TIMI血流0～2级和TMPG 0～1级比例较对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。替罗非班组LVEF较对照组明显改善,主要心血管事件较对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论急诊PCI术中冠状动脉内注射替罗非班减少无复流,改善心肌灌注和心功能,且不增加心血管事件和并发症。

HIV-1跨膜蛋白gp41重组抗原的表达及其免疫反应性

目的为开发和建立敏感、特异的抗HIV-1抗体的检测方法研制重组gp41抗原。方法根据HIV-1的基因序列,设计并合成了1对PCR扩增引物,应用PCR技术从HIV-1外膜基因组中扩增出HIV-1的gp41截短体,将扩增的基因片段插入质粒pET-28a中构建成重组表达质粒pET-gp41。诱导表达并纯化gp41重组抗原,对gp41进行了初步应用分析。结果gp41在大肠埃希菌BL21(DE3)中获得高表达,表达量占菌体总蛋白量的26.08%。纯化后截短体gp41的纯度为97.94%。经间接ELISA和免疫印迹检测,纯化后的表达产物gp41具有很高的抗原特异性和免疫反应性。结论研制的重组抗原gp41有较强的抗原性和潜在的应用价值。

抑凋亡蛋白Survivin及P-糖蛋白在骨肉瘤中的表达与骨肉瘤化疗耐药性关系的研究

目的探讨抑凋亡蛋白Survivin及多药耐药基因mdr1表达的P-糖蛋白(P-gp)的表达与骨肉瘤临床病理特征间的关系。方法应用免疫组织化学技术(SP法)检测34例骨肉瘤组织及30例骨软骨瘤(对照组)组织中抑凋亡蛋白Survivin及多药耐药基因mdr1表达的P-糖蛋白的表达,统计分析Survivin、P-gp在骨肉瘤组织中表达的相关性和其表达情况与病例临床特征的相关性。结果①34例骨肉瘤组织标本中19例Survivin蛋白表达阳性为55.9%(19/34),27例P-gp表达阳性为79.4%(27/34);对照组30例标本中未检测到Survivin蛋白表达、P-gp表达(P<0.01)。②39例骨肉瘤患者中发生转移的病例16例,其Survivin蛋白、P-gp表达水平显著高于未发生转移病例(P<0.05)。结论抑凋亡蛋白Survivin及多药耐药基因mdr1表达的P-gp的在骨肉瘤组织中呈现高表达,且两者表达水平与骨肉瘤病理分级和转移成正比。

冠心病患者血浆内皮素及血小板四项的相关性及临床意义

目的探讨内皮素(ET)、血小板四项在冠心病中的相关性及临床意义。方法选择2007年7月至2008年5月就诊于山西省人民医院并确诊的126例冠心病患者及同期45名经冠状动脉CT或冠状动脉造影除外冠状动脉病变并根据临床及实验室检查排除心脏疾患的健康对照组作为研究对象。冠心病组据世界卫生组织(WHO)的诊断标准和国内冠心病分类标准分为稳定型心绞痛组(SAP)、不稳定型心绞痛组(UAP)、急性心肌梗死组(AMI),分别检测血浆ET含量及血小板参数值。冠心病组中有16例进行经皮冠状动脉腔内成形术(PT-CA),检测术前与术后ET与血小板参数值。结果发现冠心病组测得ET、平均血小板体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)值显著高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.01),血小板计数(PLT)冠心病组低于对照组,差异无统计学意义(P<0.05)。试验结果显示随着病变程度的加重,ET、MPV、PDW值有不同程度的升高,均显著高于健康对照组。PTCA术前上述指标明显高于术后,差异有统计学意义(P<0.05)。结论ET、血小板参数存在相关性,且对冠心病的诊治及预后具有重要临床意义。

热疗对肺癌A549细胞P-糖蛋白表达影响的实验研究

目的研究不同温度、不同加热时间下热疗对肺癌A549细胞P-糖蛋白(P-gp)表达的影响,为肺癌的热疗和热化疗提供理论依据。方法体外复苏与培养肺癌A549细胞;对照组37℃下培养,实验组按不同时间、不同温度分组水浴加热肺癌A549细胞后培养24 h,采用流式细胞术(FCM)观察热处理后的肺癌A549细胞株P-gp表达的变化。结果流式细胞术显示各热疗组A549细胞的P-gp的表达率均较对照组下降,且P-gp的表达率与加热的时间和温度均呈负相关。结论热疗可以抑制P-gp的表达,可能是逆转肿瘤细胞多药耐药的一种手段。