绵、山羊性控精液的制作技术与应用研究进展

绵、山羊性控精液的生产与应用大大提高了群体扩繁的效率,推动了羊产业快速发展。自性控精液技术发展以来,研究者们虽取得了一定的科研成果,但在羊生产中的应用仍然十分有限。本文系统综述了羊性控精液分离技术的发展及不同因素(包括品种、个体差异、稀释液配方、冷冻程序、饲养管理)对绵、山羊性控精液制作的影响,并阐述了羊性控精液的推广应用及前景展望,为绵、山羊性控精液高效分选、输精技术的研发及推广应用提供参考。

葡萄糖对绒山羊精子冷冻保存及代谢的影响

旨在研究葡萄糖对绒山羊精子冷冻保存及代谢的影响。本研究将混合后的精液样品,在含有不同浓度葡萄糖(0、28、56、84和112mmol·L^(-1))的冷冻稀释液进行冷冻-解冻,利用计算机辅助精液分析系统(CASAS)、流式细胞仪和酶标仪检测精子的运动性能、精子DNA完整性、顶体完整性、质膜完整性和精子中ROS和Ca2+水平,以及精子中ATP浓度、精子悬浮液中乳酸和丙酮酸浓度。结果表明,在冷冻稀释液中添加56mmol·L^(-1)葡萄糖可以显著提高绒山羊精子冷冻-解冻后的精子活力、完整顶体和完整质膜的精子比率(P<0.05),但各组间完整DNA的精子比率差异不显著(P>0.05)。56mmol·L^(-1)葡萄糖组精子细胞中ROS水平极显著高于其它各组(P<0.01);28和56mmol·L^(-1)葡萄糖组精子细胞中Ca2+水平极显著低于其它各组(P<0.01);与其它各组相比,56和84mmol·L^(-1)葡萄糖组精子细胞中ATP浓度极显著升高(P<0.01)。精液解冻后,在低葡萄糖浓度组(28~56mmol·L^(-1))的精子悬浮液中未检测到乳酸,而112mmol·L^(-1)组检测到大量乳酸(P<0.01);当冷冻稀释液中添加低浓度的葡萄糖(28~84mmol·L^(-1)),葡萄糖对精子悬浮液中丙酮酸的产生存在剂量依赖性作用,而高浓度(112mmol·L^(-1))组中丙酮酸产生减少(P<0.05)。综上表明,在冷冻稀释液中添加56mmol·L^(-1)葡萄糖可以促进绒山羊精子冷冻-解冻过程中的代谢,提高其冷冻保存效果。

布尔山羊细管冷冻精液研制初报

首次在国内建立了布尔山羊的细管精液冷冻程序。试验证明，选用３０ｇ／Ｌ的葡萄糖、１３ｇ／Ｌ的柠檬酸钠和１ｇ／Ｌ的乙二胺四乙酸钠（ＥＤＴＡ）作基础稀释液，乙二醇作保护剂，精液冻前经１００ｍＬ／Ｌ卵黄处理，离心除去精清。精液稀释并经冻前处理后装入０．５ｍＬ细管，在４℃下平衡１．５ｈ，再以１１～３０℃／ｍｉｎ的速率降温至－８０℃以下（３～５ｍｉｎ）投入液氮，可获得良好的冷冻效果。用乙二醇作保护剂的冷冻精液，解冻后在１２～１５℃的常温下放置２４ｈ，其活力仍可满足输精的要求。

青山羊精子中乳酸脱氢酶同工酶的研究

用琼脂糖凝胶电泳技术，对山东青山羊精子中ＬＤＨ同工酶进行研究。结果表明，９只青山羊精子中均检出４条ＬＤＨ同工酶谱带。即ＬＤＨ－１、ＬＤＨ－３、ＬＤＨ－４和ＬＤＨ－ｘ。ＬＤＨ－ｘ酶带位于ＬＤＨ－４和ＬＤＨ－５之间，电泳迁移率近于ＬＤＨ－５，含量为ＬＤＨ的７５％，６５℃处理５ｍｉｎ稳定。本文结合ＬＤＨ－ｘ同工酶特殊功能，对其生理意义和临床意义进行讨论。

山羊精子结合和内化外源DNA的特征及影响因素

外源DNA与精子相互作用后的定位及内化率是精子载体法制备转基因动物的关键环节。实验以标记的DNA片段为示踪材料，就精子与外源DNA相互作用的基本特征及影响因素进行了研究。结果表明：山羊精子可自发性结合外源DNA，外源DNA最初结合于顶体后区质膜外表面，随后部分内化进入细胞内。精子对外源DNA的结合和内化能力随供体的不同而差异明显，在实验所检查的35只公羊中，结合率（DNaseⅠ消化前）波动于4．6％～62．4％，内化率（DNaseⅠ消化后）波动于2．1％～53．8％，个体间差异显著（P〈0．01）。对于同一供体的精子而言，阻止DNA结合的最主要因素是精浆，与射出的原精液相比，洗涤后精子的结合率和内化率分别提高了3倍和5倍；其次精子获能也将导致结合率和内化率降低（P〈0．01）。死精子不能完成外源DNA的内化过程，但反复冻融导致质膜破裂的死精子具有更高的结合率，而且阳性率与动物个体无关。上述结果提示，筛选合适的精子供体，采用优化的转染处理方法是提高精子载体方法效率的前提和保证。

不同处理对山羊精子转染外源DNA效率的影响

将采集的山羊精液去除精清,分为鲜精组、冻精组、反复冻融致死组3组进行处理后,与地高辛标记的线性化PCS2EGFP质粒共育转染,用免疫组化的方法检测精子转染外源DNA的效率.结果显示鲜精、冻精和反复冻融致死3种处理组的阳性转染效率分别为(36.61±7.91)%,(32.68±3.38)%,(69.36±4.79)%.反复冻融致死组转染率极显著高于鲜精组和冻精组(p<0.01),鲜精组和冻精组转染效率差异不显著(p>0.05).

肝素和钙离子载体诱导波尔山羊精子体外获能和体外受精

运用肝素、钙离子载体(IA)协同咖啡因诱导波尔山羊精子体外获能,利用去透明带金黄地鼠卵穿透试验检测了精子的获能效果。结果发现:精卵孵育4h和6h时的穿透率均高于2h时的穿透率;肝素和钙离子载体对精子获能有明显的促进作用,与未添加组相比差异极显著(P<0.01);20mg/L和50mg/L的肝素剂量组,去透明带金黄地鼠卵穿透率为64.7%、68.4%;钙离子载体的添加剂量在0.3μmol/L时,穿透率达到68.2%;咖啡因与肝素、钙离子载体具有明显的协同作用。将获能的精子与山羊卵母细胞进行体外受精孵育17h,也获得了60%以上的受精率。

鸡蛋黄和鹌鹑蛋黄在崇明白山羊精液冷冻保存中效果比较

对崇明白山羊精液采取3种不同离心处理去除精清,比较添加鹌鹑蛋黄和鸡蛋黄对精液冷冻保存效果的影响。结果表明:崇明白山羊精液冷冻保存中以1000 r/min离心5min去除精清后,添加鸡蛋黄组解冻后精子活力为50.48%,鹌鹑蛋黄组解冻后精子活力为42.98%。添加鸡蛋黄组的效果显著优于鹌鹑蛋处理组。

波尔山羊个体精子抗冻性研究

为了加速贵州省地方山羊品种改良,2000年9月试验采用常规的精液冷冻解冻方法,通过鲜精活力、畸形率、冻精活力、解冻后4 h存活指数、顶体完整率、谷草转氨酶(GOT)释放量等指标研究了3只波尔山羊精子的抗冻性,结果3只试验公羊精子抗冻性存在明显差异,968号公羊生存指数显著高于2022和098号(P<0.05),098号公羊谷草转氨酶释放量显著低于2022和968号(P<0.05),但其鲜精品质全部达到常规制作冻精的要求,配种试验,65.77 %(146/222)的受胎率也验证了3只公羊适宜制作冻精。

提高精子转染外源DNA效率的山羊精液冷冻方法

目的筛选一种既提高精子转染外源DNA效率,又保持解冻后精子活力的山羊精液冷冻—解冻方法。方法应用正交设计L9(34),因素分别为稀释液种类、稀释比例、降温时间和解冻液,每个因素选择3个水平,检测和比较解冻后精子转染外源DNA效率和精子活力。结果所选冷冻—解冻各因素对精液转染效率影响不显著[F(8,18)=1.032,P=0.449];平衡时间对冷冻—解冻活力影响极显著[F(2,24)=9.972,P=0.001],平衡1h极显著小于平衡2 h和4 h的精液活力(P=0.003,P=0.000),以平衡4 h最好。用筛选的冷冻—解冻方法处理精液,解冻后精子的活力极明显降低(P=0.002);生存指数降低,GOT释放量增加,菌落数减少,与鲜精相比差异显著(P=0.018;P=0.016;P=0.018);精子畸形率增加,顶体完整率降低,与鲜精相比差异不显著(P=0.494;P=0.084)。结论优化了提高精子转染外源DNA效率的山羊精液冷冻—解冻方法。

外源基因对精子的影响及其在山羊早期胚胎中的表达

在前期实验中发现,山羊精子可自发结合外源DNA,但结合能力在不同动物个体之间差异显著。挑选结合能力明显不同的3只公羊,进一步探讨了外源DNA对精子的影响及其在早期胚胎中的表达,结果发现:外源基因与精子共同孵育后,精子的活率、顶体反应发生率和受精能力均呈下降态势,其降幅与精子的结合能力密切相关。利用与DNA共育后的精子进行体外受精,外源基因可被导入卵母细胞并在早期胚胎中获得表达,但胚胎阳性率因精子供体不同而差异显著(P<0.05);其中来源于高、中结合能力供体生产的胚胎,分别有16.2%(25/154)和5.3%(4/76)可检测到外源基因存在,但表达仅见于高结合能力供体生产的早期胚胎,表达率为6.5%(10/154);低结合能力供体生产的胚胎无外源基因。研究表明,在以精子载体方法生产转基因动物的实验过程中,筛选对DNA结合能力较强的精子供体是提高转基因效率的前提,但需要考虑外源DNA对精子受精能力的影响。

肝素浓度对辽宁绒山羊精子体外获能的影响

在TALP液中添加不同浓度(25、50、100μg/mL)的肝素对辽宁绒山羊精子进行获能处理,在显微镜下检测处理1、2、3、4、5h后的精子活力,用考马斯亮蓝染色法检测获能处理0.5、1、2、4h后的精子获能状况,探讨肝素浓度对绒山羊精子活力、存活时间、获能率的影响。结果发现,在38.5℃、5%CO2、饱和湿度条件下,精子活力随肝素浓度升高而下降,3 h以后25μg/mL肝素组精子活力显著高于其它肝素组(P<0.05)。添加肝素组获能率显著高于对照组(P<0.05),各肝素组精子获能率差异不显著(P>0.05)。对照组精子存活时间最长,25μg/mL肝素组精子存活时间为10.12 h,显著高于其它两组(P<0.05)。表明25μg/mL肝素处理辽宁绒山羊精子体外获能较为适宜。

脂质体法介导山羊精子转染外源DNA最适条件的研究

研究了阳离子脂质体介导山羊精子转染外源DNA的方法、效果及其影响因素以确定其最适转染条件,为进一步用此方法生产转基因动物提供参考.结果显示:①脂质体介导法可用于山羊精子转染外源DNA;②脂质体介导转染1、2、3号公羊的精子消化后阳性率分别为25.2%,22.6%,27.5%,差异不显著(p>0.05).③脂质体介导转染的精子消化前后阳性率在充分洗涤组为41.3%和25.5%,极显著高于原精液直接加入1∶10∶1转染液不洗涤处理组的25.6%和11.4%及原精液加入不含缓冲液的转染液处理组的17.2%和7.8%(p<0.01).④离心洗涤后精液分别与在转染缓冲液中加入0、0.1%、0.3%、0.6%BSA(质量/体积)的转染液共同孵育后的消化前后阳性率分别为41.3%和25.5%、35%和21.4%、27.5%和15.3%及11.2%和8.2%;⑤用不同缓冲液配制的转染液进行脂质体介导山羊精子转染外源DNA的效率有差异,其中以mDM液转染精子的消化前、后阳性率最高(为41.3%和25.5%).研究表明:脂质体介导转染外源DNA的独特机制使供精个体间精子转染效率趋于一致;精子与脂质体-DNA复合物混合前将精子充分离心洗涤可显著提高脂质体介导精子转染外源DNA的效率;血清白蛋白能降低脂质体对精子介导的转染效率;脂质体法介导山羊转染外源DNA的最适转染条件为用mDM液充分洗涤精子后再与脂质体-DNA复合物混合转染.

山羊精清中抗氧化酶活性与精子活力的相关性分析

为探讨山羊精清中抗氧化酶活性与精子活力的关系。选择年龄3岁左右、平均体重47.2kg±3.5kg的健康种公羊20只,采集精液,对精液品质初步评价后离心分离精清,测定GSH-Px、SOD、CAT抗氧化酶活性及T-AOC,然后与精子活力进行相关性分析。结果表明:GSH-Px、SOD的酶活性与精子活力极显著相关,其相关系数分别为0.592(P=0.008)和0.873(P=0.001);CAT活性与精子活力的相关性接近显著(P=0.065)。说明在山羊精清中抗氧化酶GSH-Px和SOD发挥重要的抗氧化作用。

葡萄籽原花青素对山羊精液低温保存效果的影响

为提高精液低温保存质量,在山羊精液低温保存基础稀释液中分别添加浓度为0、10、30、50、70 mg/L葡萄籽原花青素,检测精液保存过程中各组之间的精子活率、顶体完整性、质膜完整性、线粒体活性、T-AOC、MDA等精子质量评定指标,探讨葡萄籽原花青素对山羊精液低温保存效果的影响及最适添加浓度。结果表明:一定浓度葡萄籽原花青素可提高精液保存质量,且最适添加浓度30 mg/L。在30 mg/L处理组中,精液各项指标(MDA除外)在保存期间均最高,且5 d时精子活率、顶体完整率.、线粒体活性、T-AOC显著高于其他组(P<0.05),其精子活率为51.46%,顶体完整率为67.55%,质膜完整率为50.97%,线粒体活性为50.78%。

以淫羊藿为主的中草药对陕北白绒山羊冷冻精液品质的影响

旨在探究陕北绒山羊冷冻精液稀释液添加以淫羊藿为主的中草药提取液,对解冻后精子质量的影响。试验分取4种单方和复方提取液,按5%、10%、15%和20%等4种体积比例添加到稀释液中,制作细管冻精,比较解冻后精子活率、畸形率、顶体异常率、常温下存活时间、有效存活时间与对照组的差异。结果显示:陕北绒山羊冷冻精液稀释液添加中草药提取液,可以提高冷冻精液解冻后精液的质量。其中以添加淫羊藿、巴戟天、菟丝子、甘草等中草药的复方配方在占冷冻稀释液总量的10%时,解冻后精液质量最好:其平均值为活率0.433,精子畸形率14.28%,顶体异常率16.64%,精子存活时间和有效存活时间分别为8.00h和4.56h。

几种常用营养试剂对波尔山羊精子活率的影响

本实验旨在研究常用的几种营养试剂对波尔山羊精子活率的影响。在25℃时,第一组(果糖、葡萄糖、蔗糖)精子活率最高(0.92);第二组(鲜牛奶、卵黄)精子活率最低(0.70);第三组(果糖、葡萄糖、蔗糖鲜、牛奶、卵黄)精子活率居中(0.81),差异极显著(P<0.01);在-196℃时,第三组精子活率最高(0.51);第一组精子活率最低(0.30);第二组精子活率居中(0.48),差异极显著(P<0.01)。结果表明,对于采精后立即实施人工授精或短时间保存精液(25℃),使用糖类试剂最好;若长时间保存精液(-196℃),糖类和奶类及卵黄混合试剂最好。

双荧光探针检测冷冻对精子质膜完整性的影响

目的:检测精液冷冻对山羊精子质膜完整性的影响。方法:用假阴道法采集3只公山羊精液,经冷冻-解冻处理后,检测精子畸形率和顶体完整率,用碘化丙锭结合羟化荧光素双荧光探针标记,检测和比较精液冷冻对山羊精子质膜完整性的影响。结果:冷冻明显降低了精子的活动率[(74.43±13.78)%vs(46.25±2.69)%,P<0.01]和质膜完整率[(64.26±7.03)%vs(6.27±2.90)%,P<0.01];显著降低了顶体完整率[(80.77±10.70)%vs(58.42±18.05)%,P<0.05]。结论:冷冻使精子活动率和顶体完整率降低的同时导致精子质膜严重破损。

布尔山羊的性格行为

通过对相同饲养管理条件下(放牧+补饲)的32只布尔山羊公羊的长期观察,发现不同个体间存在着明显的性格差异,可根据其行进速度、采食速度、配种行为以及对环境声响和驱赶反应等分为稳健型、急躁型和迟钝型3种。公羊的性格直接影响其生长速度和繁殖性能,其中性格急躁型公羊性成熟较早,但周岁后体重较小,采精量较少,精子密度较差;迟钝型公羊虽然在体增重、采精量和精子密度方面有一定优势,但性成熟较晚,性欲和精子活力较差。采精、配种时动作缓慢或精力不集中,不受人们的欢迎;稳健型公羊各方面表现都比较理想,因此,在其他性能指标相同条件下,选择性格稳健的公羊更为有利。

几种抗生素对波尔山羊精液低温保存的影响

研究了稀释液中庆大霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、菌特灵新一代抗生素替代青、链霉素的添加对波尔山羊精液保存效果的影响。实验表明 ,恩诺沙星的保存效果优于其他抗生素 ,庆大霉素、诺氟沙星与青、链霉素效果相当 ,菌特灵最差。