Serological Investigation on Mycoplasma Oviovipneumoniae in Qinghai Province

[ Objective] To investigate the prevalence of Mycoplasma oviovipneurnoniae in Qinghai Province. [ Method] With positive indirect hemagglutination test kit for detecting antibodies against Mycoplasma oviovipneumoniae, 965 sheep sera and 208 goat sera were collected in Qinghai Province from 2006 to 2008 and detected. [ Result ] The positive rate of sheep sera and goat sera was 30.4% and 19.7%, respectively. The posi- tive rate of sheep sera collected from different regions ranged from 19.7% to 40.2%, and that of goat sere ranged from 6.6% to 22.2%. In addition, the incidence in winter and spring was higher than that in summer and autumn. [ Conclusion ] The infection rate of Mycoplasrna ovipneumoniae should be higher in Qinghai region than in other western regions, so it is necessary to strengthen the prevention and control of this disease.

Complete Genome Sequence of Mycoplasma ovipneumoniae Strain NM2010, Which Was Isolated from a Sheep in China

Mycoplasma ovipneumoniae, a kind of mycoplasma bacteria, commonly infects the respiratory tract causing respiratory disease in sheep and goats worldwide. Here, the complete genome sequence of M. ovipneumoniae strain NM2010 isolated from a sheep in China was reported for the ifrst time.

绵羊肺炎支原体小鼠感染模型的建立

旨在探索小鼠作为绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)实验室感染模型的可行性,筛选建立Mo感染小鼠模型的最佳方法。将60只BALB/c小鼠随机分为对照组、Mo感染组1、感染组2、感染组3和感染组4(n=12)。Mo感染组1小鼠分别滴鼻30μL和腹腔注射25μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液各1次,Mo感染组2和3小鼠分别滴鼻2和3次30μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液,Mo感染组4小鼠喉头喷雾50μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液2次,对照组用正常培养基处理。分别于感染后第0、7和14天称量小鼠体重。感染后第14天处死所有小鼠,采集血液和肺组织。通过HE染色法进行肺组织病理学检查、剖检进行肺组织病理评分、qPCR方法检测肺组织中Mo的载荷量和ELISA检测血清Mo IgG水平,确定小鼠感染模型是否建立成功及最佳建立方法。Mo感染组2和组4中小鼠体重第14天时分别比对照组显著降低17.2%(P<0.05)和21.6%(P<0.05);感染第13天,感染组2和组4小鼠出现死亡;感染后第14天剖检,Mo感染组2和组4小鼠肺部有炎症,肺病变平均评分分别为3.5和3.3,均显著高于Mo感染组1(P<0.05)和组3(P<0.05),而对照组小鼠无病变;组织病理学检查发现,Mo感染组小鼠肺可见不同程度的间质性肺炎,肺泡腔内有炎细胞浸润;对照组小鼠肺组织结构正常、完整,肺泡内未见明显细胞浸润。小鼠肺组织中Mo DNA拷贝数在Mo感染组1和组3中分别为10^(2.56)和10^(3.21)拷贝·g^(-1);感染组2和组4分别为10^(3.84)和10^(3.77)拷贝·g^(-1),且显著高于Mo感染组1(P<0.05)和组3(P<0.05),对照组为阴性。小鼠血清Mo抗体OD_(450 nm)值在Mo感染组1、组2、组3和组4分别为0.63、1.05、0.81和0.99,均显著高于对照组(P<0.05),且组2和组4均显著高于1组(P<0.05)。本研究通过1×10^(8 )CCU·mL^(-1)的Mo NJ01株菌液滴鼻2次或喉头喷雾2次均可成功建立Mo感染小鼠模型。为绵羊肺炎支原体的致病机制及防治策略研究奠定基础。

绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法的建立与应用

[目的]建立一种诊断绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR方法,确定肺炎支原体感染的靶器官。[方法]根据GenBank网站上登录的绵羊支原体16S rRNA基因序列,设计并合成2对引物,以肺炎支原体菌株基因组DNA为模板,经过PCR反应条件的优化,通过测序验证扩增产物的正确性,建立了绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR检测方法,进而应用建立的方法完成临床阳性病料肺脏、肺淋巴、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、皮肤、小肠和外周血检测以及疑似样本肺脏组织的检测。[结果]建立的巢式PCR方法可扩增出864 bp的特异性目的片段,肺脏和肺淋巴为绵羊肺炎支原体感染的靶器官,临床样本巢式PCR检出率与支原体培养鉴定结果的符合率为100%。[结论]建立的绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法可用于临床样本的实验室诊断。

基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体TaqMan检测方法的建立及其遗传演化分析

热休克蛋白70 (heat shock protein 70,Hsp70)是绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Movi)的重要膜蛋白,是机体内高度保守的生物分子,但在种间差异大,可作为分子生物学检测的候选靶区。为建立基于Hsp70基因的Movi通用型TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,并进一步了解其遗传变异情况,本研究基于GenBank中Movi的Hsp70基因特征,设计特异性的引物及探针,建立了基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体qPCR检测方法。应用建立的检测方法对88份山羊鼻拭子样品及43份疑似羊支原体性肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats, MPSG)病料进行检测。将检测结果为Movi阳性的肺组织样品进行分离鉴定,并对分离株Hsp70基因进行序列分析。结果显示,建立的qPCR检测方法其相关系数为1.00,扩增效率为96.0%,斜率为-3.411,Y轴截距为37.29。特异性强,与丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp.capri, Mmc)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae, Mccp)、莱氏无胆甾原体(Acholeplasmalaidlawii, AL)、无乳支原体(Mycoplasma agalactiae, Maga)、伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis, CP)、羊口疮病毒(orf virus, ORFV)、牛支原体(Mycoplasma bovis, Mb)等牛羊常见病原均无交叉反应;敏感性高,最低检测限为5.72 copies·μL^(-1);重复性优,组内变异系数和组间变异系数均小于1.00%。6株Movi分离株Hsp70基因全长均为1 818 bp,与其它Movi参考株核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.4%和98.0%~100.0%;进一步分析发现,山羊源Movi均比绵羊源多1个N-糖基化位点。遗传演化分析表明,其均处于ClusterⅠA亚分支(均为山羊源)。综上,本研究建立了特异性强、敏感性高、重复性优的基于Hsp70基因的Movi的qPCR检测方法。序列分析发现,不同来源Movi的Hsp70基因核苷酸同源性高;遗传演化分析证实,Movi福建株与山羊源分离株遗传关系较近。本研究不仅为Movi临床诊断提供了技术支持,更为进一步了解Movi遗传演化规律提供参考。

绵羊肺炎支原体研究进展

【现状】绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)是引起绵羊和山羊呼吸系统疾病的主要病原之一,病羊以咳嗽、气喘、流鼻液、消瘦等为主要临床症状。【问题】由于该病原具有广泛的寄主范围,病程长,体外培养困难,对抗菌药物的敏感性难以测定,致使临床选药困难,用药依从性差。因此,目前该病防控缺乏便捷且行之有效的措施,具有较高的病死率,一旦发病对羊产业造成巨大经济损失。【对策】目前有效防控措施为疫苗免疫,但缺乏针对性强的商业化市售疫苗。根据目前抗病育种研究,可以针对绵羊肺炎支原体培育新抗病绵羊品种。【结论】疫苗防控是快速有效的防控措施之一,但由于流行病原无交叉保护性,且成本较高,无法满足新疆羊产业发展需要,因此,培育抗绵羊肺炎支原体的绵羊新品种十分必要且意义深远。

绵羊肺炎支原体致病机制研究进展

绵羊肺炎支原体是引起羊传染性胸膜肺炎的重要病原之一,是一种以咳嗽、喘气、渐进性消瘦以及肺间质增生性炎为特征的慢性呼吸道疾病,给羊养殖业造成了巨大的经济损失和动物生产力的下降。综合近期国内外关于绵羊肺炎支原体致病机制的文献报道,本文对Mo的黏附、免疫损伤机制进行了阐述,以期为我国绵羊支原体性肺炎的研究和防治提供参考。

绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

[目的]克隆绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)EF-Tu基因,原核表达获得EF-Tu蛋白,制备抗EF-Tu蛋白的兔源多克隆抗体,为研究肺炎支原体EF-Tu蛋白的结构和功能奠定基础。[方法]采用重叠延伸PCR方法将pET-28a-EF-Tu质粒中EF-Tu基因中间的TGA密码子突变为TGG,并对测序结果与其他支原体参考株进行相似性比对和遗传进化分析,利用在线软件对其推测的蛋白序列进行生物信息学分析。将突变后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定,利用镍柱亲和层析法纯化,以纯化的EF-Tu融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA和Western blotting检测多克隆抗体效价及免疫反应性。[结果]试验成功突变了EF-Tu基因中TGA位点,并构建了融合表达His标签pET-28a-EF-Tu′原核表达载体。生物信息学分析表明,克隆的EF-Tu基因与绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌株相似性最高,亲缘关系最近;编码387个氨基酸,无N-糖基化位点和跨膜区域,存在10个丝氨酸、20个苏氨酸、4个酪氨酸磷酸化位点,二级结构由无规则卷曲(35.14%)、α-螺旋(26.87%)、延伸链(26.87%)及β-转角(11.11%)构成。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,目的蛋白大小约为43 ku,蛋白纯化浓度为0.615 g/L。ELISA和Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体效价可达1∶128 000,能够特异性识别EF-Tu融合蛋白,具有良好的免疫反应性。[结论]本研究成功突变了EF-Tu基因的TGA密码子,原核表达并纯化获得EF-Tu融合蛋白,制备其多克隆抗体效价为1∶128 000,为后续研究肺炎支原体EF-Tu蛋白结构和生物学功能及其疫苗研发提供了试验基础。

绵羊肺炎支原体GH3-3株全基因组测序及生物信息学分析

【目的】全面了解绵羊肺炎支原体GH3-3株的基因序列,研究其潜在的致病机制及其复制、转录、翻译过程的调控机制。【方法】采用体外培养,利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取绵羊肺炎支原体GH3-3株基因组DNA,进行全基因组测序。【结果】绵羊肺炎支原体GH3-3株基因组大小为1060772 bp,GC含量为29.66%,基因组组分分析后发现,GH3-3株的基因组含有730个编码基因,总长度为914379 bp,平均长度为1252.57 bp,占基因组全长的86.2%。串联重复序列共149个,总长为20926 bp,占基因组全长的1.97%。微卫星DNA序列102个,tRNA 30个,rRNA 3个。在NR、SwissProt、GOG、KEGG、GO、CARD、CAZy、PHI、TCDB、RMS数据库中,分别有719、459、473、394、449、33、5、180、113、59个基因被注释;在VFDB数据库中,共注释到了76个毒力因子相关的基因。将基因组序列提交至NCBI网站,获得登录号为:PRJNA1051969。【结论】获得了绵羊肺炎支原体GH3-3株完整的基因组信息,预测和注释了其基因的功能,明确了GH3-3株以及与国内外其他绵羊肺炎支原体菌株之间的遗传进化关系。

宁夏地区绵羊肺炎支原体感染的流行情况调查

为初步掌握宁夏回族自治区绵羊(滩羊)感染绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)的流行情况,采用建立的Taq Man-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,对2022-2023年间采集自宁夏地区不同县(区)的400份绵羊鼻拭子样本进行实时荧光定量PCR检测与分析,结果显示,宁夏地区的7个县(区),包括同心县、灵武县、平罗县、永宁县、贺兰县、利通区和盐池县等地的绵羊Mo的检测结果均有阳性。随机采集的绵羊鼻拭子400份中,检测出Mo阳性有329份,平均阳性检出率为82.25%。不同县(区)之间比较,同心县、灵武县、平罗县、永宁县、贺兰县、利通区和盐池县Mo阳性率分别为80.32%、93.42%、79.59%、78.18%、82.25%、80.43%和76.47%,其中灵武县的Mo阳性率最高,与其他几个县(区)的Mo检出率相比均差异极显著(P<0.01),盐池县最低。不同月龄之间比较,3~5月龄Mo检出率最高(100.00%),与1~2月龄和2~3岁羊检出率相比均差异极显著(P<0.01);6~8月龄Mo检出率次之,与1~2月龄和2~3岁羊检出率相比均差异极显著(P<0.01);1月龄以内Mo感染率最低(10.00%),与3~5月龄和2~3岁羊检出率相比均差异极显著(P<0.01)。结果表明,所调查的宁夏地区7个羊养殖主要县(区)均有Mo感染,并且流行范围较广且阳性率高,其中滩羊在3~5月龄是Mo感染的高峰阶段。

绵羊肺炎支原体核糖体蛋白30S rpsE基因的原核表达及多克隆抗体的制备

旨在了解绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)30S rpsE蛋白的生物学特性及其蛋白免疫原性。用在线分析软件预测30S rpsE蛋白的理化性质、B细胞抗原表位、糖基化位点、二级结构及三级结构等;采用PCR方法从病羊鼻拭子样品中扩增得到30S rpsE基因片段,经NdeⅠ、XhoⅠ酶切纯化后,将其连接到pET-42b载体上,构建原核表达载体pET-42b-30S rpsE,使用不同浓度IPTG诱导蛋白在大肠杆菌BL21中表达;重组蛋白通过SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,用镍层析法纯化蛋白后,与弗氏佐剂1∶1混合注射免疫家兔,然后采取全血,检测血清抗体效价及特异性。结果:经预测30S rpsE蛋白是亲水无信号肽的膜外蛋白,无跨膜结构域,有一个糖基化位点;成功构建了原核表达载体pET-42b-30S rpsE,表达的重组蛋白分子量约为25.9 ku,以包涵体和可溶性的形式存在;免疫家兔后血清抗体效价为1∶25 600,证实30S rpsE蛋白具有较好的免疫原性。

绵羊肺炎支原体P110/LppT黏附素家族保守区的原核表达和免疫原性分析

绵羊肺炎支原体(Mo) NM2010株的P120蛋白与猪肺炎支原体(Mhp)的黏附素P110高度同源,同属于P110/LppT黏附素N端结构域家族。为了筛选用于研制广谱绵羊支原体肺炎疫苗的保护性抗原,本试验利用生物信息学方法对Mo NM2010株P120蛋白的保守区段、结构、B细胞抗原表位进行预测分析,并对P120基因的N端和C端2个保守区基因片段进行克隆、表达、可溶性分析和抗原特性分析;2个表达产物分别对兔进行免疫试验,用ELISA方法检测免疫兔血清抗体效价和IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子浓度。结果显示,P120蛋白N端有信号肽和1个跨膜螺旋,亚细胞定位在外膜,可能是一种外膜蛋白,P120蛋白N端和C端2个保守区段均有较多B细胞线性抗原表位,具有较好的抗原性;经序列测定证实,合成的P120-N和P120-C 2个基因片段的基因序列完全正确,长度分别为1 509 bp和741 bp,表达的重组蛋白分子质量分别为58.1 kDa和29.5 kDa;P120蛋白N端以可溶和包涵体2种形式存在,C端以包涵体形式存在,均具有良好的抗原性;新西兰大白兔经4次免疫后,重组蛋白P120-N组和重组蛋白P120-C组兔血清中均产生了特异性抗体IgG,效价分别为1∶512 000和1∶128 000;与阴性对照组相比,重组蛋白P120-N组和重组蛋白P120-C组兔血清中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ浓度均极显著升高(P<0.01)。结果表明,重组蛋白P120-N和P120-C可以诱导试验动物机体的体液免疫反应,P110/LppT黏附素家族保守区可以作为广谱绵羊支原体肺炎疫苗的候选蛋白。

绵羊肺炎支原体不同分离株的致病性比较

为研究不同绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)的致病性差异,筛选出致病性强的Mo菌株。通过间接免疫荧光技术检测不同Mo分离株(XJ15、XJ13、XJ22、1412、XJN)、标准株(Y98)对山羊气管上皮细胞(goat tracheal epithelial cells,GTEC)的黏附力强弱,将不同Mo菌株以109 CCU/mL浓度,0.2 mL/只,接种到7日龄SPF鸡胚的卵黄囊中,设阴性对照组和空白对照组,检测并观察Mo感染鸡胚致死率以及死亡鸡胚病理变化,记录鸡胚死亡时间,取死亡鸡胚的尿囊液进行PCR鉴定,同时对各个感染组的卵黄囊液进行PCR检测。结果显示,6株Mo均能黏附GTEC细胞,其中XJ15黏附力最强,XJN黏附力最弱。在鸡胚感染试验中,6株Mo均能引起鸡胚死亡,且不同Mo感染组鸡胚死亡数差异显著(P<0.05)。其中,XJ15感染组致死率为90%,1412和XJN感染组致死率为20%。感染组死亡鸡胚表面有出血,充血症状,尿囊液PCR检测均为阳性。表明,筛选出XJ15为致病性较强的Mo分离株,为后期Mo人工感染模型的建立奠定基础。

宁夏某羊场绵羊肺炎支原体的分离鉴定及病理组织学观察

为了确定宁夏某羊场发生一起以体温升高、咳嗽、呼吸困难为临床特征且具有传染性的疾病的病原,采集濒死病羊的病理组织,应用细菌分离培养、分子生物学鉴定、病理组织学观察及免疫组织化学分析等方法对采集的病料进行病原检测和诊断。结果显示,细菌分离培养获得3株支原体分离株,分子进化分析发现其均属于绵羊肺炎支原体,与国际标准株Y-98的序列一致性为100%。病理组织学观察显示,肺泡上皮细胞坏死、增生,支气管管腔内和肺泡腔内大量炎性细胞浸润,支气管和气管黏膜上皮细胞坏死、脱落、固有层水肿、炎性细胞浸润。对不同脏器的免疫组织化学分析显示,绵羊肺炎支原体主要集中于肺脏和气管内,且肺脏的阳性组织百分比最高,其次是支气管和气管。结合疫病的流行病学调查,该羊场所发疾病为运输应激后感染绵羊肺炎支原体导致,该病原侵染并定植于肺脏、气管及支气管上皮细胞,引起羊严重的呼吸道病症。

一例多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌及肺炎支原体混合感染绵羊的诊断

【目的】2022年7月新疆某地区羊场600只2月龄羔羊,其中100只出现反应迟钝、食欲下降、腹泻、体温高达40℃、死亡羔羊高达60只,部分出现不同程度的气喘、流鼻液和呼吸障碍,为了诊断该羊场出现的疾病。【方法】通过观察患病羊群的临床发病情况、对病死羊群的解剖检查、流行病学研究以及实验室检查。【结果】根据临床症状和解剖特征初步判断为肺炎,细菌检测为杆状革兰氏阴性菌,PCR检测多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌为阳性、绵羊肺炎支原体检测为阳性。【结论】确定了新疆某地区羊场的呼吸道病变是由多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌及绵羊肺炎支原体的混合感染造成的。

天峻县羊传染性胸膜肺炎病的诊治

利用细菌分离培养方法和PCR方法对天峻县快尔玛乡某养殖户中2只病死绵羊组织进行检测,经细菌分离培养未分离到可疑病原,用PCR方法检测2只病死绵羊肺脏及1号羊脾脏,均为绵羊肺炎支原体阳性。综合临床症状、常规检测以及PCR检测结果,诊断为羊群感染了绵羊肺炎支原体,从而导致了传染性胸膜肺炎。

从湖羊肺脏中分离绵羊肺炎支原体的鉴定

从新疆湖羊肺脏病料中分离出一株支原体XJ-3f,用其培养物人工感染80日龄健康绵羊,28d后剖杀,剖检可见肺表面肉粉色实变,显微病理变化为大灶性融合性肺炎。参考国际已知支原体16SrRNA序列,设计一对扩增700bp片段的通用引物,直接提取肺脏组织DNA进行PCR扩增并克隆、测序。将该序列与GenBank中33种支原体序列比较,结果证明该序列与绵羊肺炎支原体(M.ovipneumonia)标准株Y-98同源性为99.9%,而与山羊支原体山羊亚种(M.capricolumsubsp.capricolum,Mcc)、丝状支原体山羊亚种(M.mycoidessubsp.Capri,Mmc)、丝状支原体丝状亚种LC型(M.mycoidessubsp.mycoidesLC,M.mmLC)等同源率为81%。以感染羊血清和Y-98与从发病羊肺脏中分离出的三株支原体菌体蛋白进行Westernblot,证明均与感染羊血清有特异性反应,且与Y-98相比无明显差异,故确定分离株为绵羊肺炎支原体(M.ovipneumonia)。

绵羊肺炎支原体p113基因的序列分析及功能预测

采用多种软件对p113基因的相似性、跨膜结构、重复序列、信号肽、抗原表位等进行预测,并与同源序列进行比较分析.结果表明,p113基因是猪肺炎支原体黏附素基因p97的直系同源基因,并具有与P97蛋白R2区类似的特征性重复序列.通过综合比较分析,推测P113蛋白极可能是绵羊肺炎支原体的黏附素和膜表面免疫原.

山羊传染性胸膜肺炎病原分离与鉴定

本试验从传染性胸膜肺炎的山羊体内分离获得两株支原体Y1和Y2,通过病原分离、形态学观察、生化试验、HA、生长抑制试验和代谢抑制试验等试验,证实Y1和Y2的形态与培养特性、生化反应特性和血清学特性分别与模式株丝状支原体山羊亚种PG3和绵羊支原体Y98相接近；动物回归试验成功复制出山羊传染性胸膜肺炎的典型临床症状和病理剖解变化。结果表明Y1和Y2分别为丝状支原体山羊亚种和绵羊支原体。

绵羊肺炎支原体的微生物学特性的研究

绵羊肺炎支原体是山羊和绵羊呼吸道中最常见的支原体 ,引起非进行性肺炎 (CNP)。 2 0 0 1～ 2 0 0 2年对河北省的保定、邢台、邯郸、廊坊的 6个种羊场的绵羊、山羊通过微量间接血凝试验 (IHA)进行血清学检测 ,发现绵羊肺炎支原体的自然病例的阳性检出率为 84 .2 % ;并且从病羊的肺脏和鼻腔中分离出 18株支原体 ,经过理化特性鉴定与生长抑制试验定型 ,证明其中 12株为绵羊肺炎支原体 。