膝沟藻毒素Gonyautoxins的分离纯化

目的 从微小亚历山大藻 (AlexandriummimutumHalim)Amtk 2中分离纯化膝沟藻毒素gonyautoxins。方法用凝胶色谱、离子交换色谱等方法从人工培养的微小亚历山大藻Amtk 2酸酒精萃取物中分离纯化膝沟藻毒素。结果 从 10 0LAmtk 2培养液中获得 ( 6 74± 0 31)× 10 9个藻细胞 ,其酸酒精萃取物经凝胶色谱分离首次在国内得到膝沟藻毒素GTX 4 ,GTX 1,GTX 3和GTX 2混合物 ( 2 9 5 9± 0 2 8)mg。从此混合物中取出 4 0 6mg经两次离子交换色谱纯化得到纯GTX 4 ( 0 4 0± 0 0 0 2 )mg ,GTX 1( 5 95± 0 0 3)× 10 - 2 mg ,GTX 3( 6 92± 0 0 5 )× 10 - 4mg和GTX 2 ( 0 11±0 0 0 5 )mg。结论 人工培养的微小亚历山大藻Amtk 2酸酒精萃取物通过凝胶色谱和两次离子交换色谱分离能够得到纯的膝沟藻毒素GTX 4 ,GTX 1,GTX 3和GTX 2。

Isolation and Purification of Gonyautoxins from Two Strain of Alexandrium minutum Halim

Aim To study isolation and purification of Gonyautoxins from two differentstrains of Alexandrium minutum Halim. Methods Ethanol extracts of the two culture strains ofAlexandrium minutum Halim were fractionated by gel filtration and ion exchange chromatography toobtain gonyautoxins. The toxin profiles were tested by HPLC method. Results Both strains containgonyautoxin-1, gonyautoxin-2, gonyautoxin-3 and gonyautoxin-4. The total gonyautoxin content ofAmtk4 strain is almost 10 times higher than that of Amtk2 strain. Conclusion Alexandrium minutumHalim Amtk4 strain is suitable for the preparation of Gonyautoxins.

塔玛亚历山大藻的麻痹性贝毒研究

对暨南大学水生生物研究所于199芹年10月从香港海域底泥分离后于实验室人工培养的塔玛亚历山大藻运用高效液相色谱分析麻痹性贝毒的组成；按照美国分析化学家协会的小白鼠生物检定标准方法测试其毒性。结果表明，所含毒素成分主要是膝沟藻毒素-2（GTX2），含量为94.13×10－12g／cell;次要成分是膝沟藻毒素-4的N-磺基氨基甲酸衍生物C4，含量为15．67×10-12g／cell，测得其毒性为（3．23－4.11）×10－6MU／Cell。研究表明，所用的微藻麻痹性贝毒的提取方法和高效液相色谱分析方法都比较容易和有效。

膝沟藻毒素液质联用快速检测及其在海洋生物体内的累积

采用高效液相色谱-质谱联用技术分析了微小亚历山大藻中的膝沟藻毒素(Gonyautoxin,GTX1,4和GTX2,3)以及蒙古裸腹溞和菲律宾蛤仔摄食该藻后对膝沟藻毒素的累积状况。结果表明,采用高效液相色谱-质谱联用方法,可快速(4h内)检测出这三种海洋生物中的膝沟藻毒素,且培养的微小亚历山大藻每个细胞的膝沟藻毒素含量为9.46fmol。蒙古裸腹溞摄食微小亚历山大藻2h、18h、24h后,其体内GTX1,4的含量分别为4.8908、12.6241、31.4968mg/g,GTX2,3的含量分别为1.656、3.8533、10.9026mg/g,且对GTX1,4积累量比GTX2,3高,在24h内GTX1,4含量是GTX2,3的2.89倍。菲律宾蛤仔摄食微小亚历山大藻2h、24h和48h后,肌肉中GTX1,4含量分别为3.1271、3.6709和4.6906μg/g,GTX2,3含量分别为7.1874、8.1675和9.1476μg/g;内脏团中GTX1,4含量分别为4.7088、4.2178和5.5064μg/g,GTX2,3含量分别为7.6774、9.1476和13.066μg/g,表明GTX1,4和GTX2,3在肌肉中含量逐步增加,且GTX2,3累积量比GTX1,4高,在48h内肌肉GTX2,3含量是GTX1,4的1.95倍,内脏团GTX2,3含量是GTX1,4的2.37倍。在停食净水培养96h后,内脏团和肌肉对GTX1,4消解率已达100%,而肌肉和内脏团对GTX2,3消解率分别为16.1%和45%。本文结果表明采用高效液相色谱-质谱联用方法能快速测定赤潮藻、浮游动物和贝类中的膝沟藻毒素含量,但不同生物对膝沟藻毒素有不同的累积方式。

柱后衍生高效液相色谱法检测膝沟藻毒素

探讨柱后衍生条件和流动相条件对膝沟藻毒素群(GTXs,麻痹性贝毒的一类)的反应荧光强度和分离效果的影响。柱后衍生条件分析结果显示,各GTXs对反应液pH值、温度、甲酰胺体积分数以及甲酸铵浓度等柱后衍生反应条件的感度有较大差异。确定最佳柱后衍生反应条件为70mmol/L高碘酸与含0.12mol/L氢氧化钾和0.75mol/L甲酸铵的20%甲酰胺溶液的混合液作为柱后衍生反应液、pH7.3～7.5、流速0.8min/mL、柱后反应温度50C。流动相条件分析结果显示,甲醇体积分数、庚烷磺酸钠浓度、pH值和磷酸浓度均显著影响各GTXs的保留时间和分离效果,确定最佳流动相条件为甲醇体积分数1%、庚烷磺酸钠浓度1.5mmol/L、磷酸浓度10mmol/L、pH7.3。灵敏度分析结果显示,除GTX2无明显差异外,GTX1、GTX3和GTX4的灵敏度分别为大岛法的4.7、3.4、3.8倍。

香港海域毒性微藻Alexandium tamarense的麻痹性贝毒研究

对从香港海域底坭分离并培养的毒性微藻塔玛亚历山大藻（Alexandiumtamareuse）的毒性和麻痹性贝毒素的组成进行研究。由生物试验测得其毒性为4．11×10－6MU／cell，用高效液相色谱分析毒素的组成，结果表明所含麻痹性贝毒成分主要是膝沟藻毒素－2（GTX2），含量为94.13pg／cell，本研究所用的微藻毒素提取方法和高效液相色谱分析方法都比较容易和有效。

膝沟藻毒素GTX2,3完全抗原的HPLC及免疫学鉴定

通过醛化法将膝沟藻毒素(GTX2,3)分别与血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)偶联制备完全抗原,高效液相色谱法(HPLC)检测醛化反应前后游离GTX2,3的浓度,完全抗原免疫Balb/C小鼠,间接酶免疫吸附试验检测免疫后血清中抗体效价。GTX2,3与KLH及BSA偶联反应前溶液中毒素的浓度分别为760μg.mL-1和660μg.mL-1,偶联反应后毒素的浓度分别为191μg.mL-1及256μg.mL-1,Balb/C小鼠经过5次免疫后血清的效价为1:500。结果表明,反应后游离的GTX2,3的浓度降低,制备的GTX2,3完全抗原免疫小鼠后小鼠产生抗GTX2,3抗体,说明GTX2,3与载体蛋白发生偶联反应,偶联物具有免疫原性。

分子印迹固相萃取联用高效液相色谱分离测定海水中的膝沟藻毒素GTX1,4

采用分子印迹技术,以鸟嘌呤核苷为虚拟模板,本体聚合,合成GTX1,4的分子印迹聚合物(MIP)。傅里叶红外变换光谱(FT-IR)和扫描电子显微镜(SEM)的结果显示,MIP具有分布均匀、大小均一的孔穴。平衡吸附实验表明,分子印迹聚合物(MIP)比非分子印迹聚合物(NIP)具有更高的结合容量,对膝沟藻毒素GTX1,4有更好的选择性。用MIP填充固相萃取小柱(MISPE),以0.1 mol/L乙酸溶液为淋洗液,甲醇-水(95∶5,V/V)溶液为洗脱液时回收率最高,达到85.0%。用优化后的淋洗洗脱条件测定微小亚历山大藻和塔玛亚历山大藻藻液中的GTX1,4,分别为1.10和0.99μg/L,RSD分别为3.3%和4.4%,说明本方法具有较好的检测限和较高的测定精密度。

高效毛细管电泳法测定膝沟藻毒素2和3

目的：建立膝沟藻毒素（gonyautoxin，GTX）2和3的毛细管电泳分析方法。用毛细管电泳法分析和定量GTX免疫原。方法：用磷酸氢二钠-柠檬酸为运行缓冲液的区带毛细管电泳紫外检测法，对GTX2和3进行检测。结果：GTX2在0．5—118．0μmol／L，GTX3在0．5—39．0μmol／L时，有良好的线性关系。GTX2最低检测限为0．38μmol／L，GTX3最低检测限为0．36μmol／L（S／N≥3）。日内精密度为：GTX2是2．5％，GTX3是2．6％；日间精密度是：GTX2为5．6％，GTX3为6．3％。用该法定量GTX2＆3免疫原中GTX2的浓度为325．8±32．8μmol／L，GTX3的浓度为287．6±15．1μmol／L。结论：用磷酸氢二钠-柠檬酸为运行缓冲液的高效毛细管电泳法，可对GTX2＆3相关样品进行快速而又灵敏的分析和定量。

营养环境对微小亚历山大藻C4生长和产毒的影响

为考察营养成分以及培养基础液再利用对一株微小亚历山大藻的生长和产毒的影响,采用单因素实验分别研究了氮(NaNO_3)、磷(NaH_2PO_4)、微量元素(FeCl_3、Na2EDTA、CuSO_4、Na_2MoO_4、ZnSO_4、CoCl_2、MnCl_2)、维生素(Vitamin B12、Vitamin H、Vitamin B1)、碳(NaHCO_3)的不同含量以及海水(培养基础液)利用方式(不循环与循环利用)对微小亚历山大藻C4生长、毒素含量(μmol/L)与毒素组成的影响。结果显示,氮、磷浓度对C4藻的毒素总含量(μmol/L)有显著影响,其他因素影响均不显著;氮、磷、碳及微量元素的浓度对GTX1/4(GTX1+GTX4)在总毒素(GTX1+GTX2+GTX3+GTX4)中所占比例均影响显著,而维生素浓度和海水循环利用对GTX1/4所占比例影响均不明显。氮浓度在0~883μmol/L范围内,毒素含量与氮浓度呈正相关关系,氮浓度进一步增加,毒素含量没有明显变化;磷浓度在0~145.2μmol/L范围内增加,毒素含量先增后降,最终保持稳定的趋势。最佳的产毒条件为氮883μmol/L,磷18.15μmol/L,微量元素为f/2海水培养基中微量元素的0.5倍,碳不添加。

膝沟藻毒素GTX1-4单克隆抗体的制备与鉴定

研究膝沟藻毒素GTX1-4单克隆抗体的制备方法。利用甲醛法合成GTX1-4人工抗原,通过小鼠免疫和单克隆抗体技术制备GTX1-4单克隆抗体。结果显示,合成了免疫抗原GTX1-4-BSA和检测抗原GTX1-4-KLH,其偶联比分别为10.7∶1与22.4∶1。筛选出3株能稳定分泌GTX1-4单克隆抗体的杂交瘤细胞1-A4、5-E11和5-A11。5-E11、1-A4诱生腹水单克隆抗体的亚型分别为IgG1和IgG2a,效价均达到64000;5-A11诱生腹水单克隆抗体的亚型为IgG1,效价达到128000。5-A11诱生腹水单克隆抗体的灵敏度为6.25μg/mL,特异性较强。本实验成功合成了GTX1-4人工抗原,并获得了能够稳定分泌GTX1-4单克隆抗体的杂交瘤细胞株。