表达HIV-1 gp160膜蛋白靶细胞的制备及鉴定

目的获得表达INV-1 gp160膜蛋白的靶细胞,用于HIV-1特异性细胞毒性淋巴细胞(CTL)和抗HIV-1重组毒素细胞杀伤活性检测。方法采用PCR方法,从质粒pJen 10中扩增HIV-1 gp160基因,插入pGEM-T载体,测序后克隆入pIRESl neo载体中构建成重组质粒pIRE160,酶切鉴定正确后,转染人肝癌细胞(SMMG-7721),CA18加压筛选至细胞不再死亡为止,并采用Western blot和间接免疫荧光法对制备的靶细胞进行检测。结果HIV-1 gp160在SMMC7721表面表达,并裂解为gp120和gp41蛋白。结论已成功得到稳定表达HIV-1 gp160的靶细胞,且表达的蛋白具有良好的特异性。

HIV-1 gp160多表位嵌合基因的构建及表达蛋白的免疫原性分析

HIV感染引起的AIDS已经成为严重影响人类健康和社会发展的全球性疾病。酶联免疫吸附试验和免疫印迹检验组合则被认为是HIV检测的"金标准"。构建了gp160的抗原多表位融合基因及在原核系统的高表达,为HIV抗体测定提供特异、价廉的抗原。选定HIV-1gp160基因中3个片段包含较多抗原表位的区域,设计带有酶切位点的引物,用PCR的方法从HIV-1HXB2全基因扩增编码这3个片段的基因序列,通过质粒提取、酶切、测序方法鉴定基因片段的正确性,SDS-PAGE和Western blot测定融合蛋白的抗原特异性。构建的HIV-1gp160多表位嵌合基因的原核表达质粒,酶切和测序结果表明基因序列正确,基因全长969bp。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的重组蛋白分子量为37kDa,以包涵体的形式存在。应用Western blot测定10例正常人和12例HIV/AIDS病人血浆显示HIV-1gp160多表位融合蛋白具有良好的抗原特异性。成功构建了高表达HIV-1gp160多表位蛋白的原核表达系统,纯化的融合蛋白有较强的抗原特异性。

HIV-1 gp160截短蛋白在酿酒酵母中的表达

利用PCR技术从pNL-43上扩增出截短的编码gp160蛋白的基因片断,克隆到酿酒酵母表达载体YEpFLAG-1上构建表达质粒YEp-gp160Δ12,电转化到酿酒酵母中,用缺色氨酸的SC培养基筛选出阳性克隆,重组子经YP培养基诱导后进行全菌蛋白的SDS-PAGE和Western Blotting分析,筛选出高表达菌株.纯化后的重组gp160Δ12(rgp160Δ12)蛋白经ELISA鉴定显示具有良好的生物活性.

人免疫缺陷病毒Ⅰ型膜糖蛋白gp160人单链抗体

人获得性免疫缺陷综合症（ＡｃｑｕｉｒｅｄＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＳｙｎｄｒｏｍｅ，简称ＡＩＤＳ）主要是由人免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ１）引起的严重危害人类健康的传染病。ＨＩＶ研究的最新进展揭示了膜糖蛋白ｇｐ１２０与其受体和中和抗体复合物晶体结...

CD4^+单核细胞中HIV-1 gp120与gp160质粒的构建与表达

采用ｐＳＭＴＥ７作为质粒，进行ＨＩＶ－１ｅｎｖ基因对ＣＤ４阳性单核细胞Ｕ９３７－２的导入与表达，ｅｎｖ基因导入细胞在微量重金属镉的诱导下，激活启动子表达ｇｐ１２０及ｇｐ１６０，经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ转移显色后，可得到清晰的ｅｎｖ目的条带．此外，通过流式细胞仪对表达的ｇｐ１２０与ＣＤ４位点的结合作了分析，验证了该表达蛋白的结构与活性．从实验系可以观察到表达ｇｐ１６０的ＣＤ４细胞株由于表达ｇｐ１６０而引起细胞死亡，而表达ｇｐ１２０的细胞株在表达ｇｐ１２０时不受任何影响．

Expression of HIV-1 env Glycoprotein gp120 and gp160 in Vaccinia Virus System and Their Antigenicity Analysis

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)is the principal causative agent of AIDS which is threatening human health. The most important antigen of HIV1 is the viral envelope glycoprotein, gp160. The mature form of the HIV-1 gp160 is made up of two major regions:the extracellular (gq120) and the transmembrane (gp41) domains. The gp120 binds with high affinity to CD4. he cellular receptor for HIV-1, and antibodies that prevent the CD4-gq120 interaction are able to block HIV-1 infection. A principal neutralizing deter-

HIV-1功能性膜蛋白基因gp160的快速筛选和鉴定

目的应用假病毒感染实验快速筛选可用于HIV-1中和抗体测定的功能性膜蛋白基因。方法从HIV感染样品中扩増全长膜蛋白基因gp160,通过系统进化树分析确定其基因亚型,将HIV-1gp160阳性克隆与pSG3△Env质粒共转染293T细胞制备假病毒并对其感染能力进行分析,筛选功能性膜蛋白基因。结果克隆和鉴定了我国HIV-1流行毒株的9个功能性膜蛋白基因,系统进化树分析表明其中包括4个CRF07_BC、2个CRF01_AE和3个B亚型毒株,这些gp160膜蛋白基因所制备的假病毒具有良好的感染性。结论不同亚型HIV-1功能性膜蛋白gp160克隆为选择HIV-1中和抗体测定毒株提供了有价值的实验材料。

序贯联合应用HIV-1 gp160腺病毒载体疫苗的体液免疫效果研究

目的探讨序贯联合应用Ad5-HIVgp160疫苗与其他艾滋病疫苗所诱导的特异性体液免疫反应效果。方法用Ad5-HIVgp160疫苗、其他腺病毒载体和腺病毒相关载体疫苗以不同免疫程序分别免疫豚鼠,通过ELISA和中和实验方法检测其诱导的免疫反应,比较疫苗联合免疫组豚鼠与疫苗单独免疫组豚鼠诱导的体液免疫反应的强度。结果不同免疫程序的豚鼠均能检测到针对HIV gp120的HIV结合抗体和针对HIV敏感株sf162的中和活性;联合疫苗组诱导的gp120特异性抗体滴度和病毒中和活性高于单独免疫组,但无显著性差异。结论 Ad5-HIVgp160疫苗单独或与其他疫苗联合使用均能诱导高水平的体液免疫反应,能激发针对HIV敏感株产生中和活性的抗体。

HIV-1 gp160多表位嵌合基因的构建及表达蛋白的免疫原性分析

目的：HIV感染引起的AIDS已经成为严重影响人类健康和社会发展的全球性疾病。酶联免疫吸附试验和免疫印迹检验组合则被认为是HIV检测的“金标准”。因此本实验构建gp160的抗原多表位融合基因及在原核系统的高表达,为HIV抗体测定提供特异、价廉的抗原。方法：选定HIV-1 gp160基因中三个片段包含较多抗原表位的区域,设计带有酶切位点的引物,用PCR的方法从HIV-1HXB2全基因扩增编码这三个片段的基因序列,通过质粒提取、酶切、测序方法鉴定基因片段的正确性,SDS-PAGE和Western Blot测定融合蛋白的抗原特异性。结果：构建的HIV-1 gp160多表位嵌合基因的原核表达质粒,酶切和测序结果表明基因序列正确,基因全长969bp。在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达的重组蛋白分子量为37kDa,以包涵体的形式存在。结论：应用western blot测定10例正常人和12例HIV/AIDS病人血浆显示HIV-1 gp160多表位融合蛋白具有良好的抗原特异性。成功构建了高表达HIV-1 gp160多表位蛋白的原核表达系统,纯化的融合蛋白有较强的抗原特异性。

一例HIV-1急性感染者奠基病毒的gp160基因序列特征及其假病毒构建

目的观察急性感染期艾滋病病毒I型（HIV-1）gp160的全长基因序列及感染特征。方法从一例处于Feibig I期HIV-1感染者血浆中提取RNA,扩增gp160全长基因并测序,分析其生物学信息;将gp160全长基因与pcDNA3.1His/V5真核表达载体连接,构建Env-pcDNA3.1真核表达质粒,与骨架质粒pNL4-3.Luc.R-E-共转染293细胞,包装出假病毒。用包装的假病毒感染ghost细胞,测定感染细胞的荧光素酶活性（RLU）,鉴定假病毒的感染活性。结果成功扩增出gp160全长基因,嗜性预测为CCR5,N-糖基化位点数与标准株HXB2相同,但gp120糖基化程度更高,氨基酸变异主要集中在V1-V5区。假病毒感染试验显示,RLU值达到7log。结论获得了处于急性感染期的HIV-1gp160基因序列和高感染活性的假病毒。

以Rev依赖性凋亡增强HIV-1 gp160的抗原性

目的 检测Rev(HIV的调控基因 )依赖性肿瘤坏死因子受体 (TNFR 1)和gp16 0双重表达质粒pDM12 8 TNFR 1(pT12 8)的凋亡诱导功能。方法 采用基因枪转导及流式细胞仪检测新质粒的表达功能。结果 新结构具有特异的选择性表达作用。当Rev存在时 ,能间接表达TNFR 1,明显诱导HeLa细胞凋亡 ,使绿荧光细胞百分率非常显著地低于阴性对照 (P <0 .0 1)。等质量转染时 ,TNFR 1表达量少于Hup6 0TNFR 1的pDC30 2 (pT6 0 ) ,故间接表达不及单纯pT6 0的直接表达 ,绿荧光细胞百分率显著高于pT6 0转染组 (P <0 .0 1)。培养 40h ,才有明显杀伤功能并接近单纯pT6 0 ,差异无显著性 (P>0 .0 1)。单纯pT12 8不能直接表达TNFR 1,绿荧光细胞百分率非常显著地高于单纯pT6 0转染组 (P<0 .0 1) ,接近阴性对照 ,培养 40h时差异无显著性 (P >0 .0 1)。当AD8或pMD +pRnv存在并表达Rev时 ,pT12 8均能表达TNFR 1,杀伤HeLa细胞 ,绿荧光细胞百分率非常显著地低于阴性对照 (P <0 .0 1)。pT12 8与pRev或AD8转染人正常的角质生成细胞时 ,能表达TNFR 1,诱导细胞凋亡。培养 72h后 ,阴性对照和单纯pT12 8组的绿荧光角质生成细胞数皆显著地超过pT12 8+pRev和pT12 8+pAD8组 (P <0 .0 1)。结论 pT12

HIV-1B/C重组毒株gp160假病毒的构建及其活性检测

目的以CD4＋T细胞DNA为模板,进行gp160扩增,构建艾滋病病毒Ⅰ型（HIV-1）前病毒假病毒,通过中和试验验证其具有感染活性。方法选择高效抗反转录病毒治疗（HAART）成功的病人3例,分离外周血单核细胞（PBMC）,纯化CD4＋T细胞,提取DNA,以其为模板扩增gp160全长基因,并克隆到pcDNA3.1（＋）表达载体上,酶切验证得到阳性克隆。将此阳性克隆和pNL4-3质粒共转染,获得HIV-1假病毒。用免疫兔血清验证假病毒的感染活性。结果成功地获得了1株假病毒。用免疫后的兔血清测定半数抑制浓度（IC50）的滴度约在1∶901∶270之间。病毒的加入量与细胞感染率之间存在良好的线性关系,说明该假病毒感染系统可以通过细胞感染率较好地反映出感染性病毒的含量。结论获得了具有感染活性的HIV-1B/C重组型假病毒。

HIV-1和HBV复合型DNA免疫的初步研究

近年的研究表明，在啮齿类和非人灵长类免疫带有编码病毒和细菌抗原基因的质粒ＤＮＡ可以激发体液和细胞免疫应答．在本实验中，将ＨＢＶ的Ｓ基因和ＨＩＶ－１的ｇｐ１６０基因以融合形式插入到载体ｐｃＤＮＡ３中，其能表达ＨＢｓＡｇ和ｇｐ１６０的融合蛋白，并将此质粒ＤＮＡ分别直接注射到Ｂａｌｂ／ｃ小鼠和Ｓｗｉｓ小鼠．三次免疫后，用ＥＬＩＳＡ的方法初步检测ＨＢｓＡｇ和ｇｐ１６０抗原特异的抗体免疫应答均为阳性．结果说明，带有ＨＢＶ和ＨＩＶ－１融合基因的质粒ＤＮＡ直接免疫小鼠后，均激发了小鼠产生相应的免疫应答反应。