牛白血病病毒env(gp51)基因的克隆和原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

从持续感染牛白血病病毒(BLV)的羊胎肾细胞(FLK-BLV)中提取前病毒DNA,用PCR方法扩增编码牛白血病病毒gp51蛋白的env(gp51)基因,序列测定结果表明扩增片段全长828 bp。将扩增基因插入原核表达载体pET-32a构建pET-32a-gp51重组质粒,转化BL21(DE3)进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明重组融合蛋白大小约为43 000,Western-blot结果表明重组表达蛋白具有免疫反应性。以纯化的重组蛋白gp51作为抗原,建立检测BLV抗体的间接ELISA诊断方法。结果表明,抗原gp51的最佳包被浓度为2.19μg.mL-1,血清的最佳稀释倍数为1∶80,阳性判定标准确定为样品OD450 nm大于0.451。用该方法对12份参考血清进行检测,准确率为91.67%。

牛白血病病毒GP51蛋白在大肠杆菌中表达及胶体金免疫层析试纸条检测方法的建立

为了建立一种快速诊断牛白血病(BLV)的检测方法,本研究从BLV中扩增出其囊膜糖蛋白gp51基因,经测序后克隆于表达载体pET32a(+)中,构建了重组表达质粒pET32a-gp51。将其转化受体菌BL21,用IPTG诱导后表达出约42ku的目的蛋白,经western blot检测表明目的蛋白具良好的反应原性。以胶体金标记的羊抗牛IgG(Fc)抗体作为标记抗体,将纯化的His-gp51重组蛋白和羊抗牛IgG分别标记于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线,各部件按序装配形成快速诊断试纸条。对22份样本分别用试纸条和ELISA试验进行检测,2种方法的阳性符合率为88.9%(8/9),表明本研究建立的胶体金免疫层析方法简便、快捷,具有较好的特异性和一定的敏感性,适宜基层初筛诊断和现场应用。

基于牛白血病病毒gp51蛋白建立间接ELISA检测方法

本研究通过扩增gp51蛋白基因,与pET-32a连接构建重组表达载体,经表达、纯化获得重组gp51蛋白。利用该蛋白为包被抗原,通过优化反应条件,建立牛血清中BLV抗体的间接ELISA方法。SDS-PAGE鉴定表明,成功表达纯化了预期大小为47 kDa的重组gp51蛋白。Western blot鉴定表示该蛋白具有较好的抗原性,与无关血清样本无反应原性。建立的间接ELISA方法中抗原的最佳包被量为200 ng/孔,待检牛血清的最佳稀释比例为1:100,结果表明,该方法具有较好的敏感性和特异性,重复性高,与进口ELISA试剂盒的结果符合率达97.8%以上,具有较好的应用前景。