从Granulysin抗菌机理出发合理设计抗菌肽

Granulysin是一种表达于人体毒性T淋巴细胞中的抗菌蛋白,其作用相当于广谱抗菌素。随着分子模拟技术的发展,人们已经初步掌握了其结构与功能的关系,有关这方面的研究也取得了较大的进展。根据Granulysin的覆膜作用机理重新设计出具有活性的抗菌小肽,并通过实验对该片段的活性进行检验。

Granulysin结构和功能的研究进展

Granulysin是一种表达于人体毒性T淋巴细胞中的抗菌蛋白 ,它在结构和功能上跟NK lysin有很大的相似性 ,其作用相当于广谱抗菌素。虽然对于Granulysin的活性结构及作用机制在细节上还不是很清楚 ,但是 ,随着生物信息学的发展 ,人们已经初步掌握了其结构与功能的关系 ,有关这方面的研究也取得了较大的进展。

绵羊Granulysin基因的克隆与序列分析

基于电子延伸序列,设计1对克隆引物,从绵羊回肠黏膜组织中提取总RNA,进行RT-PCR,将PCR产物与pMD19-T载体连接后转化E.coliJM109感受态细胞、检测阳性克隆、测序并进行序列分析。克隆的绵羊Granulysin基因与人、牛该基因的同源性分别为56.2%和87.2%,推导的氨基酸序列信号肽为1～22氨基酸,SapB结构域为64～138氨基酸,结构特征与人、牛的一致。结果提示,绵羊Granulysin基因克隆成功。

PBC患者granulysin基因和蛋白的表达及临床意义

目的:探讨颗粒溶素(granulysin,GNLY)在原发性胆汁性肝硬化和患者(PBC)中的表达及其意义.方法:采用TaqMan探针技术,以18SrRNA为内参照,测定60例PBC患者外周血中GNLYmRNA的含量,同时应用酶联免疫吸附法(ELISA),检测PBC患者血清中GNLY蛋白的水平,并以健康体检组(n=100)和乙型肝炎肝硬化组(n=60)为对照.结果:PBC组GNLYmRNA的平均拷贝数显著高于健康对照组[(2.7±2.5)×108vs(3.0±1.9)×107,P<0.01]和乙型肝炎后肝硬化组[(2.7±2.5)×108vs(4.7±3.6)×105,P<0.001).PBC患者血清中的GNLY蛋白表达显著高于健康对照组(15.48±3.24μg/Lvs4.76±2.32μg/L,P<0.01)和乙型肝炎后肝硬化组(15.48±3.24μg/Lvs2.57±1.84μg/L,P<0.01).结论:GNLY的表达与PBC的发生、发展存在一定的相关性,可用于PBC临床诊断.

CYFRA21-1、Granulysin、miR-17-5p和miR-20a联合对早期鼻咽癌的诊断价值

目的探讨细胞角蛋白19片段、Granulysin、miR-17-5p和miR-20a联合对早期鼻咽癌的诊断价值。方法选取早期鼻咽癌患者70例为鼻咽癌组,鼻咽炎患者70例为鼻咽炎组,同时选取健康体检者70例为对照组,检测3组患者血清中CYFRA21-1、Granulysin、miR-17-5p和miR-20a的表达量。用ROC曲线下面积分析CYFRA21-1、Granulysin、miR-17-5p和miR-20a联合对早期鼻咽癌的诊断价值。结果早期鼻咽癌患者血清中的CYFRA21-1的表达量和miR-17-5p和miR-20a的相对表达量均明显高于鼻咽炎患者和健康体检者(P<0.05);但是,Granulysin的表达量明显低于鼻咽炎患者和健康体检者(P<0.05)。诊断早期鼻咽癌患者与鼻咽炎患者CYFRA21-1、Granulysin、miR-17-5p和miR-20a的灵敏度分别为76%、76%、73%,80%;特异度分别为80%、96%、93%,87%。诊断早期鼻咽癌患者与健康体检者CYFRA21-1、Granulysin、miR-17-5p和miR-20a的灵敏度分别为83%、60%、73%、93%;特异度分别为66%、86%、73%、83%。对早期鼻咽癌的联合诊断的灵敏度为86.3%,特异度为94.9%,准确度为91.9%。结论 CYFRA21-1、Granulysin、miR-17-5p和miR-20a可能作为联合诊断早期鼻咽癌的潜在标志物。

Granulysin and its clinical significance as a biomarker of immune response and NK cell related neoplasms

Granulysin is a cytotoxic granular protein that was identified from human T cells by using the gene subtraction method in 1987. Based on its amino acid homology, granulysin belongs to the saposin-like protein family. The bioactive 9-k Da form of granulysin is processed from the 15-k Da pro-product in the cytoplasmic granules. It is expressed in CD8-positive αβT cells 5 d after mitogenic stimulation and constitutively in natural killer(NK) cells and γδT cells, although regulation of its expression has not yet been precisely determined. The 9-k Da granulysin form has anti-microbial activity against microorganisms such as bacteria, fungi, mycobacteria and parasites, as well as tumoricidal activity against some tumors at 1-10 μmol/L concentrations. Granulysin is secreted in both Ca-dependent and-inde-pendent manners. In sera, only the 15-k Da form is detectable and is expected to be a biomarker for immune potency, acute viral infection, anti-tumor immune reaction, acute graft vs host disease, and NK cell associated neoplasm.

绵羊Granulysin在大肠杆菌中的表达与鉴定

根据GenBank中公布的绵羊Granulysin基因序列设计引物,用PCR法从重组质粒中扩增出含BamHI/XhoI酶切位点的Granulysin片段,双酶切后克隆至pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达质粒pGEX-Granulysin,转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导进行表达,SDS-PAGE鉴定,表达的融合蛋白分子量约为41 kDa,并以包含体形式存在。

Granulysin真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建颗粒溶解素(granulysin)cDNA真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)中扩增出颗粒溶解素蛋白cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的相应酶切位点,将此重组质粒进行序列测定,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。结果:重组质粒插入基因序列测定证实为颗粒溶解素cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。结论:成功构建颗粒溶解素真核表达载体,为进一步研究其抗结核作用奠定了基础。

抗Granulysin多克隆抗体的制备及鉴定

目的构建人颗粒溶素(granulysin,GNLY)质粒并在大肠杆菌中表达,纯化得到9kD目的蛋白片段,免疫新西兰大白兔制备兔抗颗粒溶素多克隆抗体。方法采用RT-PCR的方法获得编码人颗粒溶素的cDNA序列,将测序正确的片段克隆入pET-28a(+),构建pET28a(+)-GNLY表达载体。在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中IPTG诱导下表达6×His-融合蛋白,纯化后免疫新西兰兔,制备兔抗人颗粒溶素血清,以Western Blotting和ELISA方法分析其特异性和效价。结果6×His融合蛋白免疫新西兰兔成功获得多克隆抗体,Western Blotting结果显示制备的抗体具有较高的特异性,ELISA显示效价为1∶6000。结论获得了纯化的颗粒溶素9kD蛋白和anti-GNLY多抗血清,为今后对疾病中CTL和NK细胞活性的研究打下了基础。

Granulysin及Perforin在早期自然流产蜕膜组织中的表达

目的观察早期自然流产患者蜕膜组织中Granulysin、Perforin的表达及其在介导细胞凋亡中的相关性。方法采用免疫组织化学SP法检测30例早期自然流产(流产组)和30例人工流产(对照组)蜕膜组织中Granulysin、Perforin的表达情况,应用TUNEL法检测两组细胞凋亡指数。结果①流产组中Granulysin及Perforin的阳性表达均显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。②Granulysin与Perforin在流产组蜕膜组织中的阳性表达呈正相关(r=0.592,P<0.05)。③流产组的平均细胞凋亡指数[(7.39±3.13)%]高于对照组[(3.45±1.35)%],差异有统计学意义(P<0.05)。④流产组中,Granulysin、Perforin阳性表达组的平均细胞凋亡指数[(8.48±3.08)%,(8.15±3.02)%]均高于阴性表达组[(4.83±1.17)%,(5.00±1.93)%],差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Granulysin、Perforin与早期自然流产有关,且两者在早期自然流产的发病过程中有协同作用。

小毛莨内酯对结核病人颗粒裂解肽基因表达的作用

目的 研究小毛莨内酯 (Ternatolide ,Tern)对健康成人 ,初诊未治、耐药肺结核病人及儿童结核患儿周围血淋巴细胞 (PBL)体外活化后颗粒裂解肽 (granulysin ,GLS)mRNA表达的作用 ,探索其抗结核菌的分子免疫学机理。方法 采用反转录聚合酶链反应半定量 (QC RT PCR)方法 ,测定不同剂量的Tern对以上 4组人群PBL颗粒裂解肽mRNA表达水平的影响。结果 当Tern在 10 0mg·L-1,2 0 0mg·L-1浓度时 ,均能诱导以上 4组人群体外活化的PBLGLSmRNA的表达 ,且各组诱导表达水平无显著差异。结论 Tern可能是通过提高CTL的效应分子GLSmRNA表达的水平 ,杀灭胞内致病菌MTB ,其诱导作用呈现剂量依赖性。

颗粒裂解肽G13结构域的表达及其对大肠杆菌活力的影响

目的构建携带颗粒裂解肽G13结构域的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达目的蛋白,并检测其对大肠杆菌活力的影响。方法人工合成G13结构域编码DNA序列,PCR扩增后,用T-A克隆法与pBAD/TOPOThioFusion表达载体连接。通过PCR鉴定及测序筛选阳性重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经阿拉伯糖诱导表达,SDS-PAGE检测表达情况,同时监测诱导表达前后工程菌A600值的变化及菌液中的突变体。结果工程菌经诱导,表达出相对分子质量约15000的特异蛋白,表达量占菌体总蛋白的3%左右。随着外源蛋白的表达,菌液A600值下降,随后又缓慢上升。提取的质粒测序结果表明,其启动子的-35区和-10区均发生了突变,随着诱导时间的增加,突变细胞的比例不断增加。结论已成功构建了G13结构域原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达出G13融合蛋白。该异源蛋白的表达导致工程菌的活力降低。

人颗粒溶素与小鼠单链IL-12真核共表达质粒的构建及其在RAW264.7细胞中的表达

目的构建人天然颗粒溶素(Granulysin,GLS)和小鼠单链IL-12基因的真核共表达载体pZM02并在RAW264.7细胞中进行表达。方法将人GLS和小鼠单链IL-12基因同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,得到真核共表达质粒pZM02,以pZM02转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,通过RT-PCR、免疫细胞化学和ELISA的方法检测目的基因的表达。结果在转染后的RAW264.7细胞中同时检测到了人GLS和小鼠IL-12的表达。结论人GLS能够与小鼠IL-12在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中实现共表达,pZM02的成功构建为进一步研究GLS与IL-12的协同细胞免疫作用机制和免疫治疗作用奠定了基础。

颗粒溶素的表达纯化及生物学活性分析

目的:采用原核表达系统对颗粒溶素(granulysin,GNLY)进行体外表达,纯化及活性鉴定。方法:以体外培养的人外周血单个核细胞(PBMC)为模板,RT-PCR扩增编码GNLY的cDNA片段,插入pMD-18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a(+)-GNLY,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体经变复性后用Ni亲和层析纯化,CFU法测定蛋白活性。结果:成功地将GNLY cDNA片段插入载体pET28a(+)中,构建了表达质粒pET28a(+)-GNLY。经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为9 000的融合蛋白,变复性纯化后的GNLY蛋白经CFU法检测,发现其具有细胞毒活性且细胞毒作用具有剂量依赖性。结论:本实验利用原核表达系统成功地表达了具有生物学活性的GNLY,为研究其功能、作用机制及临床应用奠定了基础。

小毛莨内酯对结核休眠菌感染病人GLS mRNA表达的影响

目的 研究小毛莨内酯抗人体结核休眠菌感染的分子免疫学机理。方法 采用PCR方法检测结核病人PBLs中结核菌 16kDα 晶状体同源蛋白DNA阳性的 5 6例患者为本研究对象 ;采用反转录聚合酶链反应半定量 (QC RT PCR)方法 ,测定不同剂量的Tern .对以上病人PBL颗粒裂解肽mRNA表达水平的影响。结果 当Tern .在 10 0mg L ,2 0 0mg L浓度时 ,能诱导结核休眠菌感染病人体外活化的PBLGLSmRNA的表达。结论 Tern .可能通过促进颗粒裂解肽mRNA的表达 ,增强机体CTL杀菌能力 ,达到抗结核休眠菌的作用。

耻垢分枝杆菌与卡介苗作为载体在鼠结核病治疗中的作用比较

目的比较耻垢分枝杆菌(MS)与卡介苗(BCG)作为载体在鼠结核病治疗中的作用。方法分别以不同剂量的MS和BCG免疫BALB/c小鼠,观察二者的致病作用。以结核分枝杆菌H37Rv感染BALB/c小鼠4周后,分别用生理盐水、MS、GLS/IL-12、重组MS、BCG及GLS/IL-12重组BCG治疗6次,于第6次治疗后7d处死小鼠,检测肺、脾荷菌量、血清IL-12和IFN-γ水平、脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的水平及肺、脾组织中颗粒溶素表达,并观察小鼠肺组织病理改变。结果重组MS和重组BCG组器官荷菌量明显低于MS和BCG组;重组MS和重组BCG组血清IL-12和IFN-γ水平明显高于MS和BCG组,MS和BCG组明显高于生理盐水组;重组MS和重组BCG组脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的水平明显高于其他组;MS与BCG组比较,重组MS与重组BCG比较,荷菌量、病理变化、肺、脾中的IL-12和IFN-γ水平差异均无显著意义;淋巴细胞中的IFN-γ和TNF-α水平,MS与BCG组差异有显著意义,而重组MS与重组BCG组差异无显著意义;重组MS和重组BCG组在肺、脾中均有颗粒溶素表达;MS所致病变比相同剂量BCG轻。结论MS与BCG一样,可将要表达的基因靶向递送到相应的组织,并诱导特异性细胞免疫,同时其在体内的副作用低于BCG,因此可作为良好的有机载体。

GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌的构建及其在小鼠体内的表达

目的构建携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)的重组耻垢分枝杆菌,并经鼻黏膜免疫观察其在小鼠体内的表达。方法将人GLS和小鼠IL-12基因及分枝杆菌复制子OriM同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,得到穿梭质粒pZM03,以pZM03电转化耻垢分枝杆菌,再将该重组耻垢分枝杆菌滴鼻免疫Balb/c小鼠3次,第1次免疫后4周,处死小鼠,用免疫组化检测肺、脾组织中GLS表达,用ELISA检测血清IL-12和肺泡灌洗液特异性SIgA的水平。结果得到可表达GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌;在Balb/c小鼠肺、脾组织中均检测到重组耻垢分枝杆菌的分布,以及GLS的表达,并有血清IL-12水平升高和黏膜特异性SIgA的产生。结论成功构建GLS和IL-12修饰的重组耻垢分枝杆菌,该重组菌经鼻黏膜免疫小鼠后,可引起呼吸道黏膜特异性抗菌免疫,以及GLS和IL-12的体内表达,为新型疫苗的研究奠定了基础。

原发性免疫性血小板减少症患者颗粒溶素、颗粒酶B、穿孔素的表达及临床意义

目的研究颗粒溶素（granulysin，GNLY）、颗粒酶B（granzymeB，GrB）及穿孔素（perforin，PFP）三种免疫分子在原发性免疫性血小板减少症（primaryimmunethromboeytopenia，ITP）患者外周血单个核细胞（peripheralbloodmononucle—arcells，PBMC）中的表达及其临床意义。方法使用实时荧光定量PCR（RFQ_PCR）和免疫印迹法（westernblot，WB）检测30例ITP患者和40例健康人PBMC中GNLY，GrB及PFP的mRNA和蛋白含量。分析ITP患者三种蛋白含量与IL-2，IL-4，IL-10和IFN-γ的相关性。结果与健康对照组比较，ITP患者PBMC中GrB，PFPmRNA（1．78±0．13VS1.0O±0．03；1．96±0．11VS1．O0±0．04）及蛋白含量（2．05±0．19VS1．02±0．10；2．03±0．23VS0．92±0．15）均升高（t=23．016～45．594，P值均〈0．01），而GNLY变化差异无统计学意义（P〉0．05）。ITP患者中GrB，PFP蛋白表达水平与血小板数量呈负相关（r=-0．401，-0．486，P〈0．05），与IL-2（r=0．515，0．565），IFN-γ（r=0．478，0．544）水平呈正相关（P〈0．05），与IL-4，IL-10无相关性（P〉0．05）。结论GrB及PFP可能参与ITP的发病机制，为探讨ITP的病因和治疗提供了新线索。