人颗粒酶B融合蛋白对转染的HeLa细胞的作用

目的 观察颗粒酶Ｂ（ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）融合蛋白对转染的ＨｅＬａ细胞的作用。 方法用ＲＴ－ＰＣＲ法获取人ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ全长ｃＤＮＡ，经重组ＰＣＲ将活性型序列的５′端与一段 ＰＥ转膜肽序列融合。将所获重组基因克隆入绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）共表达载体ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ，转染ＨｅＬａ细胞。用免疫组化染色法检测目的蛋白的表达，荧光显微镜和电镜观察转染细胞的形态和结构。 结果成功地获得了野生型ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ｃＤＮＡ及其融合蛋白基因，并构建了融合蛋白基因与ＧＦＰ基因共表达的真核载体。转染ＨｅＬａ细胞后，检测到目的蛋白的表达。荧光显微镜观察转染细胞有两种变化：一种表现为体积增大并常伴随多核现象；另一种出现细胞质和细胞核的固缩。电镜观察显示，多核巨细胞生长状态良好，固缩的小细胞则呈现凋亡的典型特征。结论ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ融合蛋白在ＨｅＬａ细胞中异位表达，可使转染细胞的形态发生变化，出现多核的大细胞和核固缩的小细胞。

人granzyme B基因在HeLa细胞中的表达

目的 构建携带人 granzym e B基因的真核表达载体 ,并将其在 He L a细胞中表达 .方法 用反转录 PCR获取人 granzyme B全长 c DNA序列 ,将其活性型序列克隆进 pc D-NA3重组表达质粒 .脂质体法转染 He L a细胞 ,间接免疫荧光检测目的蛋白表达 ,HE染色观察其对转染 He L a细胞形态的影响 .结果 成功获得了野生型 granzym e B c DNA,构建了编码活性型 granzyme B的真核表达载体 pc DNA3- G.转染He L a细胞后观察到目的蛋白表达 ,转染细胞形态发生变化 ,出现多核大细胞及固缩小细胞 .结论 活性型 granzyme B哺乳动物表达系统的建立 ,为进一步研究 granzym e

猕猴脑胱天蛋白酶-3活化及其靶蛋白的体外研究(英文)

凋亡的主要生化过程包括胱天蛋白酶的活化及其对细胞内蛋白质的选择性切割 .在已知的胱天蛋白酶中 ,可被多种凋亡刺激信号激活的胱天蛋白酶 3备受注目 .为进一步揭示灵长类动物神经组织中未知的胱天蛋白酶 3靶蛋白 ,采用成年猕猴脑组织粗提物作为无细胞体系 ,通过加入 granzymeB引发凋亡途径的部分反应 ,如胱天蛋白酶 3的活化及随后发生的蛋白质水解 .经蛋白质印迹分析发现 ,与 granzymeB共孵育后 ,猕猴脑胱天蛋白酶 3以两步方式从酶原转化为活性酶 .对猕猴脑组织自身蛋白质的进一步分析显示 ,多聚ADP 核糖聚合酶 (PARP)被水解为长 85ku的片段 ,此片段提示胱天蛋白酶 3的特异切割活性 .此外 ,神经元凋亡抑制蛋白 (NAIP)也被切割 ,产生长约 4 0ku的小片段 ,但是它的出现不被胱天蛋白酶 3特异性抑制剂Ac DEVD CHO阻断 ,因此可能是 granzymeB直接作用于NAIP所致 .以上结果提示 ,凋亡相关酶切反应可在成年猕猴脑组织提取物中得到重现 ;NAIP可能是granzymeB而非胱天蛋白酶 3的作用靶点 .

半滑舌鳎颗粒酶B基因的克隆和表达分析

颗粒酶(granzyme,Gzm)B是免疫炎症反应必不可少的介质,可激活半胱天冬酶3,进而诱导靶细胞的凋亡。本研究通过PCR扩增和RACE技术获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)颗粒酶B基因(CsGzmBl)的全长cDNA序列,并对其序列特征和表达水平进行了分析。结果显示,CsGzmBl cDNA全长为923 bp,开放阅读框长度为780 bp,编码259个氨基酸(前19个氨基酸残基为信号肽序列),5′非编码区为49 bp,3′非编码区为94 bp。CsGzmBl的基因组结构比较保守,由5个外显子和4个内含子组成。CsGzmBl蛋白包含2个N端糖基化位点、1个催化三联体“His63Asp112Ser207”、1个“PHSRPYMA”结构域及6个保守的半胱氨酸。荧光定量PCR结果显示,CsGzmBl在半滑舌鳎健康成鱼不同组织中均有表达,其中,在脾脏中表达量最高,头肾、中肾、肝脏和鳃中表达量次之,在肌肉中表达量最低。与对照组0 h相比,CsGzmBl在哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染后的不同时间点的脾脏、肠、肝脏、皮肤、鳃和肾脏中的表达水平均有不同程度的上调。研究表明,CsGzmBl基因在半滑舌鳎抵御哈维氏弧菌感染过程中发挥重要作用。