背景:Pax6基因是影响眼发育、分化的关键基因,获得过表达Pax6基因的稳定细胞株是研究其对骨髓间充质干细胞分化作用的首要任务,也是干细胞替代治疗的研究基础。目的:构建重组慢病毒载体Pax6-EGFP,体外转染人骨髓间充质干细胞,检测Pax6...背景:Pax6基因是影响眼发育、分化的关键基因,获得过表达Pax6基因的稳定细胞株是研究其对骨髓间充质干细胞分化作用的首要任务,也是干细胞替代治疗的研究基础。目的:构建重组慢病毒载体Pax6-EGFP,体外转染人骨髓间充质干细胞,检测Pax6基因在人骨髓间充质干细胞中的表达情况。方法:利用PCR法从人Pax6 cD NA基因克隆载体p GEM-PAX6上扩增Pax6目的片段,将其与XbaⅠ和BamHⅠ双酶切的慢病毒载体pH IV-EGFP连接,转化感受态细胞DH5α,挑取阳性克隆提取质粒,测序鉴定。经293T细胞包装后,收集含病毒颗粒的上清液,体外转染人骨髓间充质干细胞,同时设立阴性对照组(p HIV-EGFP空载体)。荧光显微镜下观察转染是否成功,Real time PCR检测转染细胞Pax6基因的表达。结果与结论:(1)酶切电泳及基因测序证实携带Pax6基因的慢病毒载体构建成功,包装后获得滴度为3×109 pfu/L的Pax6-EGFP重组载体;(2)转染人骨髓间充质干细胞后,在荧光显微镜下可以发出绿色荧光,且荧光强度不随培养时间延长而衰退;(3)经Real time PCR检测,被转染细胞内有Pax6基因表达,表明慢病毒转染是一种安全高效的基因修饰手段,能够使外源基因整合到宿主细胞基因组中。展开更多
文摘背景:Pax6基因是影响眼发育、分化的关键基因,获得过表达Pax6基因的稳定细胞株是研究其对骨髓间充质干细胞分化作用的首要任务,也是干细胞替代治疗的研究基础。目的:构建重组慢病毒载体Pax6-EGFP,体外转染人骨髓间充质干细胞,检测Pax6基因在人骨髓间充质干细胞中的表达情况。方法:利用PCR法从人Pax6 cD NA基因克隆载体p GEM-PAX6上扩增Pax6目的片段,将其与XbaⅠ和BamHⅠ双酶切的慢病毒载体pH IV-EGFP连接,转化感受态细胞DH5α,挑取阳性克隆提取质粒,测序鉴定。经293T细胞包装后,收集含病毒颗粒的上清液,体外转染人骨髓间充质干细胞,同时设立阴性对照组(p HIV-EGFP空载体)。荧光显微镜下观察转染是否成功,Real time PCR检测转染细胞Pax6基因的表达。结果与结论:(1)酶切电泳及基因测序证实携带Pax6基因的慢病毒载体构建成功,包装后获得滴度为3×109 pfu/L的Pax6-EGFP重组载体;(2)转染人骨髓间充质干细胞后,在荧光显微镜下可以发出绿色荧光,且荧光强度不随培养时间延长而衰退;(3)经Real time PCR检测,被转染细胞内有Pax6基因表达,表明慢病毒转染是一种安全高效的基因修饰手段,能够使外源基因整合到宿主细胞基因组中。
