经MHCⅡ通路的屋尘螨1类变应原T细胞表位融合肽疫苗载体的构建与表达

目的构建经MHCⅡ通路的屋尘螨1类变应原Der p 1的T细胞表位肽疫苗重组载体。方法分别合成TAT、Ih C和含编码Der p 1的3段T细胞表位的融合核苷酸序列,用特异性引物PCR扩增相应的基因片段,分别用相应的双酶切后,用T4 DNA连接酶连接形成TAT-Ih C-Der p 1-3T融合基因,并插入至原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组原核表达载体p ET-28a(+)-TATIh C-Der p 1-3T,Bam HⅠ和XhoⅠ进行双酶切和测序鉴定。重组载体转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株,IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳分析和Western blot验证,纯化TAT-Ih C-Der p 1-3T蛋白后进行Ig E结合试验。结果双酶切和测序结果表明,成功构建了p ET-28a-TAT-Ih C-Der p 1-3T重组原核表达载体;SDS-PAGE电泳分析显示TAT-Ih C-Der p 1-3T可诱导表达;Western blot检测表明该融合蛋白纯化成功;Ig E结合试验表明TAT-Ih C-Der p 1-3T结合屋尘螨过敏病人血清Ig E的能力强于Der p 1变应原(P<0.001)。结论成功构建了可表达经MHC通路的编码Der p 1的3段T细胞表位的重组p ET-28a-TAT-Ih C-Der p 1-3T载体,纯化的TAT-Ih C-Der p 1-3T具有较强的Ig E结合能力,从而为后续经MHC通路的特异性免疫治疗奠定基础。

两种尘螨1类变应原嵌合基因的原核表达及生物活性鉴定

目的原核表达尘螨1类变应原（粉尘螨1类变应原仇叩和户尘螨1类变应原Derpl基因）的嵌合基因R8，并检测其生物活性。方法以含嵌合基因R8的pUCm-T重组质粒为模板，用Derel的特异性引物进行PCR扩增，产物经酶切后与载体pET28a（＋）连接，连接产物转入大肠埃希菌（E.coli）BL21感受态细胞，并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后纯化，十二烷基磺酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS．PAGE）检测；纯化后的蛋白用ELISA检测其与粉尘螨过敏患者血清（IgE）的结合能力，同时以重组rDerfl和rDerP1蛋白作为对照。为检验嵌合蛋白R8的免疫原性，将75只BALB／c小鼠随机均分为5组，分别为PBS组（阴性对照组）、rDerf1组、rDerP1组、R8组和哮喘组（阳性对照组）。除PBS组外，其余各组分别于第0、7和14天每鼠腹腔注射（0．1μg/μl）粉尘螨注射液100μ1，第21～27天每鼠每天雾化吸入0．5μg／ml粉尘螨注射液悬浊液，30min／d。rDerf1组、rDerP1组和R8组于第25～27天雾化前30min．分别腹腔注射100μg／ml的rDerf1、rDerP1和R8蛋白各200μl进行特异性免疫治疗，PBS组用等量PBS进行腹腔注射和雾化吸人。所有小鼠于第27天雾化吸入后24h气管切开，用1mlPBS进行肺泡灌洗，收集肺泡灌洗液（BALF），检测γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素4（IL-4）的水平。结果SDS-PAGE结果显示，R8表达产物的蛋白相对分子质量（Mr）约为35000。EUSA检测结果显示，嵌合蛋白R8与粉尘螨过敏患者血清IgE的结合力为（37．03±12．46）μg／ml，显著低于rDerf1[（80．44±15．50）μg／ml]和rDerP1[（90．79±10．38）μg／ml]（P〈0．01）。动物实验结果显示，R8组IFN-γ水平[（343．43±38．79）pg／ml]与rDerfl组[（322．98±30．36）pg／m1]和rDerP1组[（314．97±33．89）pg/ml]的相比，差异均无统计学意义（P〉0．05）；与PBS组[（393．93±50．68）pg/ml]和哮喘组[（208．44±46．11）pg／m1]相比，差异均有统计学意义（P〈0．01）。R8组IL4水平显著低于其他各组水平（P〈0．05或0．01）。结论表达了具有低变应原性和高免疫原性的尘螨1类变应原嵌合基因R8。

热带无爪螨第1组分变应原的同源建模及表位分析

目的:利用生物信息学方法对热带无爪螨第1组分变应原(Blo t 1)特征进行分析。方法:采用SignalP 4.1服务器用于分析Blo t 1的信号肽序列,ProtScale tools对Blo t 1的理化性质进行分析,NetPhos3.1服务器预测分析Blo t 1的磷酸化位点。采用SOPMA服务器预测其二级结构。结果:Blo t 1是一种亲水蛋白,其第1-18位氨基酸为Blo t 1的信号肽序列,磷酸化位点预测显示:Blo t 1含有16个丝氨酸激酶、12个苏氨酸激酶及16个酪氨酸激酶,没有跨膜结构域;Blo t 1的二级结构中包含α螺旋(氨基酸占比28.56%),β转角(氨基酸占比7.95%),延伸链(氨基酸占比19.05%)和无规则卷曲(氨基酸占比44.44%)。Blo t 1的B细胞表位有5个肽序列(38-43,115-118,125-130,156-159,204-212),T细胞表位预测得到3个肽序列(89-109,134-154,247-267)。结论:对Blo t 1的表位分析,为Blo t 1基于表位的疫苗和肽-ELISA的研发奠定理论基础。

粉尘螨1类变应原T和B细胞表位t合基因的构建与表达

目的：构建粉尘螨1类变应原（Derf1）的T和B细胞表位嵌合基因原核表达载体。方法将Derf1包含的5个T细胞表位（T1～T5）和6个B细胞表位（B1～B6），以B1-T1-B2-T2-B3-T3-B4-T4-B5-T5-B6和B1-B2-B3-B4-B5-B6-T1-T2-T3-T4-T5连接方式直接合成表位嵌合基因，并分别命名为Derf1A和Derf1B。构建原核表达重组质粒pET-28a（＋）-Derf1A和pET-28a（＋）-Derf1B，双酶切及测序验证的阳性克隆转化到E.coliBL21（DE3）后诱导表达。SDS-PAGE分析表达产物后进行纯化，并进行Westernblotting鉴定。ELISA法检测嵌合蛋白对粉尘螨过敏患者血清IgE抗体的结合力。结果双酶切及测序结果表明，成功构建了原核表达重组质粒pET-28a（＋）-Derf1A和pET-28a（＋）-Derf1B；SDS-PAGE分析表明，Derf1A和Derf1B诱导并纯化成功，Westernblotting结果进一步证实纯化了Derf1A和Derf1B嵌合蛋白。与Derf1相比，Derf1A和Derf1B嵌合蛋白与粉尘螨过敏患者血清IgE抗体的结合能力显著降低（P均＜0.05），但Derf1A和Derf1B间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论成功表达了Derf1的T和B细胞表位嵌合蛋白，为粉尘螨过敏的特异性免疫治疗奠定了基础。

血清IFN-γ、IL-17及HMGB1检测对儿童过敏性哮喘的诊断价值

目的探讨血清干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-17(IL-17)及高迁移率族蛋白1(HMGB1)检测对儿童过敏性哮喘的诊断价值。方法选取172例过敏性哮喘患儿为观察组,98名健康儿童为对照组。对比两组血清IFN-γ、IL-17及HMGB1水平差异,观察3项指标检测对小儿过敏性哮喘的诊断价值。结果引起过敏性哮喘的主要过敏原为尘螨81例(47.09%)、霉菌组合33例(19.19%)、粉草组合28例(16.28%)。观察组患儿血清IFN-γ水平明显低于对照组,而血清IL-17、HMGB1水平则高于对照组(P<0.05)。随着病情的加重,过敏性哮喘患儿血清IFN-γ水平逐渐降低,血清IL-17、HMGB1水平则逐渐升高(P<0.05)。IFN-γ、IL-17及HMGB1检测对过敏性哮喘诊断的ROC曲线下面积分别为0.854、0.829、0.851,联合检测诊断灵敏度与单独检测比较差异无统计学意义(P>0.05),而特异度则显著升高(P<0.05)。哮喘患儿血清IFN-γ水平与IL-17、HMGB1水平呈显著负相关(r=-0.350、-0.205,P=0.000、0.007),而血清IL-17与HMGB1表达呈显著正相关(r=0.151,P=0.047)。结论导致过敏性哮喘的过敏原主要包括尘螨、霉菌组合、粉草组合,检测血清IFN-γ、IL-17及HMGB1水平有助于过敏性哮喘的临床诊断和病情评估。

尘螨Ⅰ类变应原所致过敏性哮喘治疗的研究进展

尘螨是引起哮喘等过敏性疾病的主要气传变应原之一,其变应原种类繁多,尘螨Ⅰ类变应原是主要的致敏成分之一。本文就尘螨Ⅰ类变应原引起的螨性过敏性哮喘的发病机制、治疗及其研究进展做一综述。