猪轮状病毒Rotavirus A pig/China/NMTL/2009/G9P[23]株的分离与鉴定

A群轮状病毒(GAR)是引起人类和多种动物腹泻的主要病原体,病原的分离与鉴定是轮状病毒(RV)流行病学、病原学等研究的基础。本研究采用接种MA104细胞的方法,从内蒙古某猪场患病猪腹泻粪便中分离一株病毒,经3次蚀斑克隆纯化后,采用电镜观察、PCR鉴定和序列测定进行分析,结果表明该分离株为猪轮状病毒(PoRV)。致病性试验表明该分离株能够引起仔猪急性腹泻,RT-PCR扩增其VP4、VP6和VP7的基因节段并进行序列测定,按照A群RV的最新分类方法,确定该分离株的VP6、VP7和VP4基因型分别为I5型、G9型和P[23]型。因此,将该分离株命名为Rotavirus A pig/China/NMTL/2009/Q9P[23]。

1株G26P[23]型猪A群轮状病毒的基因组特征

目的分析2021年从福建省发生腹泻的猪场分离到的1株G26P[23]新基因型猪轮状病毒RVA/pig/CHN/FJSH01/2021/G26P[23](简称FJSH01)的分子特征。方法利用MARC-145细胞进行RV分离,采用RT-PCR方法对分离株FJSH01的全基因组进行了测定,利用在线分型工具RotaC v2.0对其基因型进行鉴定,并对其分子遗传特征进行了分析。结果分离株FJSH01的基因型图谱为G26-P[23]-I5-R1-C1-M1-A8-N1-T1-E1-H1,即G26P[23]型。分离株FJSH01的VP3、NSP1、NSP3和NSP5基因分别与人源轮状病毒RVA/Human_wt/VNM/30378/2009/G26P[19]、RVA/Human-wt/VNM/NT0077/2007/G4P[6]、Human/LL4260/China/T1和RVA/Human/Ryukyu-1120的核苷酸同源性最高,为96.01%~98.65%,其余7个片段与猪源轮状病毒(PoRV)的核苷酸同源性最高,为95.12%~97.99%,表明分离株FJSH01可能为人源轮状病毒和猪源轮状病毒重配后的病毒株。结论G26P[23]型PoRV为国内首次鉴定,研究结果丰富了PoRV分子流行病学资料,为PoRV预防控制提供理论参考。

猪A群轮状病毒的分离与鉴定

目前国内对猪轮状病毒的研究较少,作者旨在对猪A群轮状病毒进行分离与鉴定,为后续猪轮状病毒致病机理和分子生物学特性研究奠定基础。用胰蛋白酶处理RT-PCR检测猪A群轮状病毒病原阳性的临床腹泻粪样,然后接种长成单层的MA-104细胞,进行病毒分离传代。再对分离毒株进行常规RT-PCR鉴定和电镜观察,并对分离毒株的VP6、VP7和VP8基因进行测序及序列分析。结果成功分离猪A群轮状病毒TM-a株,经序列同源性分析发现,与TM-a株VP6、VP7和VP8基因同源性最高的毒株分别为中国北京人源LL3354株、印度人源RMC321株和日本野猪源GUB-71株,其相似性为96.0%、95.1%和97.0%。该TM-a株轮状病毒不同基因表现出与人源轮状病毒和猪源轮状病毒的高度同源性,推测猪A群轮状病毒可能在人畜间传播,发生基因重组现象。

猪轮状病毒G1P[7]株分离鉴定及多克隆抗体制备

旨在明确猪场腹泻原因并分离猪轮状病毒(PoRV)。采集腹泻猪粪便,经RT-PCR检测为阳性的样品接种于单层细胞,通过细胞病变(CPE)和间接免疫荧光(IFA)来检测病毒增殖;RT-PCR扩增VP4和VP7基因并测序以确定G/P基因型,生物信息学软件分析VP4和VP7基因的遗传进化特征;传代病毒灭活后制苗接种家兔制备多克隆抗体,测定中和抗体,并经Western blot和IFA鉴定其特异性。结果:猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、伪狂犬病毒(PRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)均为阴性,只有PoRV为阳性;过滤粪便样接种单层MA104细胞,连续传5代均可观察到以细胞圆缩、最后瓦解脱落为特征的CPE,IFA检测到PoRV的特异性荧光,表明病毒分离成功,命名为JSNJ2019;分离株连续传代,病毒滴度逐步升高,介于105~106.5 TCID50/mL;分离株JSNJ2019为G1P[7]基因型;3次免疫后家兔血清的中和抗体滴度最高可达211,Western blot出现特异性条带且IFA荧光亮而特异。本研究成功分离PoRV JSNJ2019(G1P[7])且免疫原性良好,制备的多克隆抗体特异性强,为研究PoRV致病机制奠定基础。

中国不同地区猪轮状病毒的分离鉴定及分子流行病学分析

为鉴定国内不同地区猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PRo V)并分析其分子流行病学特征,本研究将从我国不同地区收集病料中检测到的16份PRoV阳性仔猪粪便样品和小肠内容物处理后接种MA-104细胞,传代后进行荧光定量PCR (qPCR)和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,并经电镜观察。结果显示,其中7份样品F1~F3代病毒液qPCR Ct值均随着传代次数的升高而逐渐降低,IFA鉴定结果显示均能在细胞中观察到特异性荧光,电镜观察到直径约70 nm无囊膜的病毒粒子,表明本实验分离到7株PRoV。利用RT-PCR扩增7株分离株和其余9份PRoV的阳性样品的VP7基因并测序分析基因型,基于VP7基因进行同源性和遗传进化分析。结果显示,16份阳性样品包含3种G型,即G9(7/16)、G4 (6/16)和G3 (3/16),同时G9型FJ-2021分离株和G4型JS01-2021分离株与近两年流行株亲缘关系较近。统计16份样品中G型PRoV的地域分布,结果显示华东地区有G9、G4和G3型的流行,四川有G3和G9型流行,广东有G9型的流行,分别与华东地区、四川地区和广西地区报道的流行G型一致;除此之外,G9型在云南、辽宁、湖南均有流行,G4基因型在广西、广东、陕西、黑龙江、河南均有流行。本研究首次收集了来自我国12个省市的PRoV阳性临床样品并进行PRoV的分离鉴定,丰富了PRoV在国内的流行资料,对不同地区针对性的防控PRoV的感染提供了流行病学数据,同时为进一步研究不同G型PRoV的致病机制和疫苗研发奠定了基础。

猪A群轮状病毒BJ株的分离与鉴定

轮状病毒是引起幼龄动物和儿童病毒性腹泻的主要病原,轮状病毒的分离鉴定为该病的流行病学调查和分子生物学特性研究奠定了基础。本研究采集北京某猪场腹泻发病仔猪肠内容物,将其接种MA104细胞,分离得到一株能产生明显细胞病变的病毒。对分离毒株进行胶体金、实时荧光定量RT-PCR和免疫荧光等方法鉴定,并对分离毒株的VP4、VP6和VP7基因进行测序及序列分析。结果表明,分离毒株为猪A群轮状病毒。按照A群轮状病毒的最新分类方法,确定该分离株VP4、VP6和VP7基因的基因型分别为P[13]型、I5型和G11型。因此,将该分离株命名为Rotavirus A pig/China/BJ/2015/G11P[13]。

猪轮状病毒江西株AY01的分离鉴定

【目的】确定江西省某猪场哺乳仔猪发生腹泻的病因。【方法】对送检的仔猪小肠样品进行猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)的RT-PCR检测,将阳性样品接种MA104细胞传代进行PoRV的分离;对分离毒株进行电镜观察、间接免疫荧光试验、PoRV VP4和VP7基因序列测序和动物回归等试验。【结果】猪小肠病料样品经终浓度15μg/mL的胰酶处理37℃孵育2 h,接种MA104细胞,能在细胞上增殖传代,第6代开始表现稳定的细胞病变;电镜观察可见病毒粒子直径大小为61~70 nm,平均大小为65 nm,呈带有短纤突且外缘光滑的形似车轮状的粒子,具有轮状病毒粒子典型的形态特征;间接免疫荧光试验和RT-PCR检测均为PoRV阳性,确定该分离株为PoRV。分离株VP4和VP7基因序列分析显示,VP4基因型与P[23]基因型相似性最高,VP7基因型与G5基因型相似性最高,根据A群轮状病毒最新分类方法,分离株属于G5P[23]型。动物回归试验结果显示,经口感染该分离株的1日龄初生仔猪于感染后24 h左右陆续出现水样腹泻、呕吐等临床症状,并能在粪便中检测到PoRV。【结论】通过MA104细胞连续传代,从江西某猪场的腹泻仔猪小肠样品成功分离到1株PoRV,该分离株属于G5P[23]型PoRV,为哺乳仔猪发生腹泻的病原。

一株G4P[X]型猪A群轮状病毒的分离与鉴定

为了分离并鉴定一株A群猪轮状病毒(PoRV)。本文通过MA-104细胞分离培养、间接免疫荧光鉴定、RT-PCR鉴定以及全基因序列遗传进化对一份PoRV阳性粪便样本进行了分离与鉴定。经RT-PCR和间接免疫荧光证实为PoRV,命名为JC-3,基因型为G4-P[X]-I5-R1-C1-M1-A8-N1-T7-E1-H1,根据同源性比对分析发现,JC-3株VP1、VP6、VP7、NSP1、NSP2和NSP5基因与PoRV相似性最高,高达95.4%~99.7%,而VP2、VP3、NSP3、NSP4与人源A群轮状病毒(GAR)相似性最高,达94.6%~98.5%,表明该病毒基因组发生了重排。本研究成功分离一株猪源PoRV,基因型为G4P[X],为以后对该毒株的致病性研究奠定了基础。

猪A群轮状病毒RVA/Pig-tc/CHN/SWU-1C/2018/G9P[13]株的分离与鉴定

为分离并鉴定A群猪轮状病毒(PoRV),本研究通过MA-104细胞分离培养、间接免疫荧光鉴定、RT-PCR鉴定以及序列分析对一份疑似Po RV感染的小肠样本进行了病毒的分离与鉴定。结果显示,分离到一株Po RV,其基因型为G9-P[13]-I5-R1-C1-M1-A8-NI-T7-E1-H1,命名为RVA/Pig-tc/CHN/SWU-1C/2018/G9P[13]。经序列分析显示,该病毒的VP7、VP4、VP6、NSP1、NSP2、NSP4和NSP5基因与Po RV相似性最高,达92.9%~98.3%,而VP1~VP3、NSP3基因与人源A群轮状病毒(GAR)相似性最高,达94.1%~97.3%,表明该病毒为一株人猪重配的Po RV。经软件重组分析显示,该病毒的VP2基因在626 bp处与人源GAR R1207株发生重组,进一步证实该病毒为人猪重组病毒株。本研究首次在中国大陆报道分离鉴定到一株猪源人猪重配的G9P[13]型Po RV,为后续对其致病性研究奠定了基础。

猪A群轮状病毒SCJY-13株的分离鉴定及致病性分析

【目的】在从腹泻仔猪粪便中分离鉴定猪A群轮状病毒(Rotavirus group A,RVA)并了解其致病性。【方法】应用MA-104细胞从仔猪腹泻粪便中分离鉴定RVA,将其经口感染健康初生仔猪,观察其临床症状,并利用实时荧光定量PCR检测排毒、HE染色观察病理变化、免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)试验了解病毒分布。【结果】分离到1株可引起MA-104细胞明显细胞病变的G9P[23]RVA,命名为RVA/Pig-tc/CHN/SCJY-13/2017/G9P[23](简称SCJY-13株),病毒滴度为10^(5.5) TCID_(50)/100μL。经口感染SCJY-13株的仔猪在感染后11 h出现腹泻,持续到感染后165 h完全恢复,其发病率为100%(7/7),病死率为28.57%(2/7)。感染后8 h可从仔猪肛拭子检测到病毒核酸,直至感染后192 h,峰值出现在感染后24 h。感染后54 h各段小肠病毒载量达到最高,其中回肠中病毒载量最高,显著高于十二指肠、空肠(P<0.05);HE染色和IHC检测结果显示,SCJY-13在感染仔猪小肠的绒毛及隐窝中大量聚集,尤其是回肠段;SCJY-13株感染引起十二指肠、空肠和回肠绒毛固有层大量淋巴细胞浸润、黏膜上皮细胞和肠绒毛尖端空泡变性、柱状细胞增多、绒毛断裂脱落等,以回肠段较严重。【结论】SCJY-13株能引起新生仔猪100%发病,其主要靶位区在回肠,感染后排毒时间长。本试验结果为猪RVA的致病性研究提供了一定的参考依据。

甘孜州牦牛源A群轮状病毒的分离和鉴定

本实验的目的是分离甘孜州牦牛源A群轮状病毒(Bovine Rotavirus A,BRVA)并调查其基因型。将BRVA阳性牦牛粪便样本接种于MA-104细胞,用间接免疫荧光和RT-PCR进行病毒的鉴定,并扩增分离毒株VP4和VP7基因片段,测序确定其基因型。结果显示:6份样本盲传至第3代后均出现了细胞病变,连续传至7代后细胞病变稳定,表现为细胞圆缩,细胞大面积脱落;间接免疫荧光和RT-PCR鉴定结果显示成功分离到6株牦牛源BRVA。6株病毒的G型均为G6型,其中3个毒株的P型为P[1]型,另外3株未能确定P型。本研究为甘孜州牦牛BRVA的分子流行病学调查及其防控提供了参考。

贵州1株G9P[23]型猪A群轮状病毒的分离鉴定及基因组序列分析

为了解贵州省G9型猪轮状病毒(PoRV)流行毒株的基因组特征和遗传进化关系,本试验对送检腹泻仔猪的肠内容物和粪样进行病原检测,选取G9型PoRV阳性样品通过Vero细胞进行分离培养及病毒鉴定,并对分离毒株进行基因组遗传变异分析。结果显示,阳性样品经胰酶预处理后接种至Vero细胞,盲传至第15代出现稳定CPE,前期细胞变圆后固缩、脱落,后期胞浆界限不清,出现拉网现象,用特异性引物对细胞培养物进行RT-PCR鉴定,成功扩增341 bp的目的条带。细胞培养物的间接免疫荧光鉴定显示有特异性绿色荧光反应,电镜观察下可见晶格状排列的无囊膜病毒粒子,大小约70 nm,表明成功分离到1株PoRV,将之命名为GZZY2021。病毒增殖曲线结果显示,用GZZY2021株感染细胞后,0~12 h病毒含量最低,12~30 h病毒增殖速度最快,30~48 h病毒增殖速度较平缓,48 h病毒滴度达到峰值(10-5.60/0.1 mL),而后进入稳定期。全基因组克隆测序分析结果显示,GZZY2021分离株基因组全长为18 506 bp, 11个基因最相似序列同源性均>95.00%,VP1、VP2、VP4、VP7、NSP1、NSP3、NSP4基因与猪源毒株同源性最高,VP3基因与大熊猫源毒株相似性最高,VP6、NSP2、NSP5基因与人源毒株同源性最高,提示分离株为三元重配毒株,完整的基因型为G9-P[23]-I1-R1-C1-M1-A8-N1-T1-E1-H1。VP4、VP7基因与同型参考毒株相比,分别发生5、3处独有氨基酸位点变异;与NX疫苗株的中和表位分别存在22、4处氨基酸位点差异。重组分析结果显示,GZAS2020株的NSP5基因是以PTR(FJ422141.1)为主要亲本毒株,A411(EF990694.1)为次要亲本毒株重组产生的毒株,重组断点位于121和321 bp。综上所述,本研究应用Vero细胞成功分离到1株G9P[23]型基因重配PoRV,不但可对持续监测贵州省PoRV的流行动态趋势提供研究数据,而且对筛选该领域的候选疫苗株以及该病的深入研究打下基础。

一起仔猪大肠杆菌与猪A群轮状病毒混合感染的诊断

为了解抚顺市某猪场仔猪腹泻疫情的病因,对发病猪进行了病理剖检,并采取病料进行了细菌分离鉴定、药敏试验、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪A群轮状病毒(PRV-A)三种病毒性腹泻病原的三重实时荧光RT-PCR检测。结果表明:细菌分离鉴定所分离到的菌株培养特性及生化反应特性与大肠杆菌基本一致,经血清学鉴定所分离菌株菌体抗原血清型为O8;所分离菌株存在多重耐药现象,对四环素类、氯霉素类、磺胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类、青霉素类药物均耐药;该猪场存在PRV-A感染。

猪A群轮状病毒LN-01-2013株的分离与鉴定

将病料与等体积2.5g/L胰酶溶液混合均匀,于37℃恒温培养箱中孵育1h,分别接种于MA-104、Marc-145、ST细胞系以分离病毒并筛选该毒株最适细胞系。通过RT-PCR以及重组质粒构建对其进行分子生物学鉴定以及遗传进化分析。结果显示,成功分离出猪A群轮状病毒LN-01-2013株,MA-104细胞系为其最适细胞系。LN-01-2013株的VP4基因型与P[7]基因型同源性最高,VP7基因型与G[9]基因型同源性最高。根据A群轮状病毒最新分类方法,LN-01-2013分离株属于P[7]G[9]型。

广西猪A群轮状病毒G9P[7]型的分离与初步鉴定

猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)感染仔猪可引起腹泻、脱水甚至死亡,是引起仔猪腹泻的常见病原,给养猪业造成巨大的经济损失。本研究为确定导致广西贵港某猪场仔猪腹泻的病原,采集腹泻仔猪的肠内容物,采用PCR方法检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)以及PoRV病原,结果显示,仅PoRV为阳性,将其接种至Marc-145细胞,盲传4代后,可产生细胞皱缩、脱落等明显细胞病变。稳定盲传20代,每隔5代进行PoRV的检测,选取第10代的病毒上清液进行VP4、VP6和VP7基因测序及遗传进化分析,确定该分离株为G9 P[7]型。电镜观察,可见到大小约为70 nm的轮状病毒粒子,符合轮状病毒特征,进一步鉴定分离株为PoRV。结果表明,PoRV的分离鉴定为其分子生物学特性研究以及该病的有效防控奠定了基础,也为疫苗的研发提供参考。

猪轮状病毒G9P[7]型云南株的分离鉴定及VP4和VP7基因测序分析

为确定云南省某猪场仔猪腹泻的病原,对送检腹泻病仔猪小肠组织样品进行猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)RT-PCR检测,将PoRV检测阳性样品处理后接种至MA-104细胞进行PoRV分离;对分离毒株进行间接免疫荧光、电镜观察、胶体金检测和VP4、VP6、VP7基因测序及遗传进化分析。结果显示,仔猪肠道组织样品经终浓度20μg/mL的胰酶在37℃孵育2 h,能在MA-104细胞上增殖传代,第3代出现稳定的细胞病变,盲传20代,每隔5代进行PoRV的检测;间接免疫荧光试验可见特异性荧光,胶体金和RT-PCR检测均为PoRV阳性,电镜观察可见病毒粒子直径约为65 nm,呈车轮状,符合PoRV粒子典型形态特征,将该分离株命名为PoRV YN-A株。基因同源性比较和遗传进化树分析显示,YN-A株的VP6基因序列与国内A群GD株的同源性为99.93%,VP7与中国G9型NJ2012株的同源性为99.12%,VP4与美国P[7]型OSU株的同源性为98.91%,确定该分离株为猪A群轮状病毒G9P[7]型。YN-A株VP7序列在9个氨基酸位点存在点突变,即aa9(I→V)、aa16(V/T→I)、aa44(A→V)、aa100(D/E→N)、aa212(T/A→K)、aa221(N→S)、aa225(V→A)、aa271(I→V)、aa267(D→E)。首次从云南地区的腹泻仔猪小肠组织中成功分离到1株G9P[7]型的新基因型PoRV毒株,为PoRV的致病性、分子生物学特性研究及PoRV G9优势基因型新疫苗研发奠定了基础。

一株猪轮状病毒的分离与鉴定

将1份经RT-PCR检测猪轮状病毒阳性的临床腹泻粪样感染Vero细胞,连续盲传8代,出现病变,成功分离到1株病毒,经RT-PCR检验和电镜观察,鉴定该病毒为轮状病毒,命名为GD-01-2015。扩增该病毒的VP4和VP7基因进行分型和系统进化分析,结果发现,其VP4基因为P[7]型,与来自韩国的猪源毒株K71同源性达到99.8%;其VP7基因为G5型,与来自韩国的猪源毒株06-6-1同源性达到99.7%。由此可以推测GD-01-2015株与韩国猪源毒株有相似的进化来源。根据轮状病毒分类委员会(RCWG)提出的A群轮状病毒的最新分类方法,GD-01-2015株基因型为G5P[7]。本研究为监测轮状病毒的流行状况及其疫苗的研制提供了理论依据。