Ⅰ群禽腺病毒Hexon蛋白的截短表达与鉴定

本研究利用PCR方法扩增出Ⅰ群禽腺病毒FAVⅠhexon基因主要抗原区,连接于表达载体pGEX-4T-1中,构建成重组质粒pGEX-hexon,并转化大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导表达,对表达的Hexon蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western-blot分析。结果显示,试验成功扩增获得hexon基因主要抗原区序列,大小为1020bp。重组蛋白主要以包涵体形式存在,融合蛋白大小为63.1ku,与预测值相符。经Western-blot分析,表明重组蛋白与FAVⅠ的阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性,为FAVⅠ诊断试剂盒的研制奠定基础。

Ⅰ群4型禽腺病毒DC株在LMH细胞的增殖工艺研究

为探索Ⅰ群4型禽腺病毒DC株在LMH细胞的生长特性和增殖规律,通过研究病毒接种量、收毒时间、接毒时间、温度和维持液血清浓度等病毒增殖条件,筛选、优化了病毒增殖工艺。结果表明病毒最佳的增殖条件为:在37℃条件下培养,最佳接种量为1%,接种时间为细胞传代后生长72 h,维持液血清浓度为2%,维持液中不添加0.25%胰蛋白酶,收获时间为病毒接种后72 h。LMH细胞是Ⅰ群4型禽腺病毒DC株较适合的病毒培养系统,为研制Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗提供了有利工具。

Ⅰ群禽腺病毒五邻体蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立一种简便、快速检测Ⅰ群禽腺病毒(FAVI)抗体的间接ELISA方法,以表达和纯化的FAVI五邻体重组蛋白作为抗原,优化反应条件,建立了FAVI间接penton-ELISA抗体检测的方法。抗原最佳包被浓度为1.5μg/孔,最适包被条件为37℃,2h后4℃过夜;血清最佳稀释度为1∶100;酶标二抗的最佳工作浓度为1∶2000;ELISA阴、阳性临界值为0.335。用penton-ELISA方法检测100份鸡血清样品,阳性率为41%。

Ⅰ群禽腺病毒间接33K-ELISA检测方法的建立

【目的】建立一种鉴别I群禽腺病毒(FAVI)灭活苗免疫和野毒感染的检测方法,为FAVI的防控与净化提供技术支撑。【方法】以FAVI33K重组蛋白为包被抗原,筛选和优化间接ELISA的条件,建立FAVI抗体的间接33K-ELISA检测方法,检验其特异性、敏感性和重复性,并鉴别检测FAVI活病毒感染血清和灭活苗免疫血清各50份。【结果】33K重组抗原最佳包被浓度6.0μg/mL,包被条件为37℃孵育1h后4℃过夜,最佳封闭液为5%脱脂奶,封闭时间1.0h;待检血清稀释度1:100,抗原抗体最佳作用时间1.0h;酶标二抗最佳稀释度1:3000,作用时间45min。优化后的间接33K-ELISA的阴、阳性临界值为0.316。其特异性、敏感性、重复性试验及鉴别检测结果表明,优化后的间接33K-ELISA具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点,且能成功鉴别FAVI感染与灭活疫苗接种。【结论】间接33K-ELISA操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好、适于批量检测,可有效鉴别FAVI感染和灭活苗免疫接种,利于挑选出FAVI感染动物,为FAVI的防控与净化提供了新思路和新方法。

Ⅰ群禽腺病毒Hexon蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立与应用

旨在原核表达Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus groupⅠ,FAVⅠ)的Hexon蛋白,并以Hexon蛋白为包被抗原建立血清的间接ELISA检测方法。将FAVⅠ群Hexon基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中进行重组Hexon蛋白的诱导表达,对表达产物进行纯化,并进行Westernblot鉴定;纯化后的Hexon蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立血清的间接ELISA检测方法,并进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后对临床样品进行检测。结果表明,原核表达获得大小约为37.4ku的重组Hexon蛋白;Westernblot结果表明重组蛋白有良好的特异性和抗原反应性。FAVⅠ间接ELISA法优化反应条件为:抗原最佳包被质量浓度为5.0mg/L,封闭条件为37℃作用1h,血清以1∶200倍稀释作用1h,酶标二抗以1∶5 000倍稀释作用1h,TMB显色时间为10min。在该优化条件下,OD_(450)≥0.322为阳性,反之为阴性;特异性试验结果表明,对鸡新城疫、禽流感、沙门菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌阳性血清检测均为阴性;对阳性血清的敏感性可达1∶1 200,70份阳性血清的阳性率为97.1%;重复性试验结果表明,批内和批间OD_(450)值的变异系数分别为1.2%~3.5%和5.1%~8.3%;用此方法对临床279份鸡血清样品检测的阳性率为51.3%。表明建立的ELISA检测方法可用于FAVⅠ抗体水平的检测。

Ⅰ群禽腺病毒套式PCR检测方法的建立与应用

本研究根据GenBank发表的Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)基因序列,设计了2对通用检测引物,通过反应体系和条件优化,建立了Ⅰ群禽腺病毒套式PCR检测方法。通过灵敏性检测、特异性试验以及对临床病料中FAdV检测验证实用性与可靠性。建立的套式PCR检测方法灵敏度为3.12×10-6 ng/μL;特异性试验证实该方法仅能从FAdV参考阳性株扩增出750 bp的预期目的条带,其他5种常见禽病毒均为阴性。结果表明,本研究成功建立了一种灵敏度高、特异性好的检测Ⅰ群禽腺病毒通用套式PCR方法,为临床FAdV感染的快速准确诊断提供了技术手段。

Ⅰ群4型禽腺病毒DC株灭活苗对流行毒株的保护力试验

为了检验Ⅰ群4型禽腺病毒(FAdV-4)DC株对几个流行毒株的保护力,使用含有DC株的鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、传染性法氏囊病、禽腺病毒病(Ⅰ群4型)(La Sota株+BX13株+BJQ902株+DC株)四联灭活疫苗免疫SPF鸡,免疫接种后21 d采血测定FAdV-4中和抗体,然后分别用DC株和2015年-2017年分离的5个FAdV-4分离株(ZB2016株、ZD2015株、SC2016株、DT1-2017株和DT2-2017株)进行攻击,观察新流法腺四联苗对FAdV-4流行毒株的保护效果。结果显示,免疫组鸡FAdV-4中和抗体效价达到9.6 log2~10.1 log2,而对照组鸡中和抗体为0;免疫鸡用DC株、ZB2016株、ZD2015株、SC2016株、DT1-2017株和DT2-2017株攻毒后,免疫组鸡得到100%(10/10)保护,对照组鸡90%(9/10)~100%(10/10)发病。试验证明,用含DC株制备出的新流法腺四联苗对腺病毒的流行毒株具有较好的保护效力。

我国Ⅰ群禽腺病毒主要流行血清型及其防控

对2007~2017年从我国主要养殖区临床病料中分离的86株禽腺病毒(FAd V)血清型鉴定结果表明,我国流行的主要血清型为FAd V-11、FAd V-4、FAd V-8b和FAd V-8a,常与鸡传染性贫血病病毒混合感染。蛋鸡流行的FAd V血清型主要为FAd V-4(88.9%),肉鸡主要为FAd V-11(47.6%),而危害最大的是FAd V-4引起的心包积水-肝炎综合征。在鸡LMH细胞上进行的交叉中和试验结果表明,FAd V-4的高免阳性血清可中和其自身和FAd V-11,但不能中和FAd V-8a、FAd V-8b。提示,有必要研制FAd V-4、FAd V-8a和FAd V-8b三价灭活疫苗和FAd V亚单位通用疫苗。

Ⅰ群禽腺病毒双价油乳剂灭活苗的研究

【目的】提高国内I群禽腺病毒疫苗的防控能力,防止I群禽腺病毒蔓延。【方法】优化I群禽腺病毒的增殖条件,以I群禽腺病毒血清4型(FAV-4)及血清8型(FAV-8)的抗原液制备油乳剂单价及双价灭活苗,比较甲醛及β-丙内酯(BPL)的灭活效果,并检验疫苗性状、监测免疫抗体水平及进行免疫攻毒试验和田间试验。【结果】疫苗灭活以1.00mL/L终浓度的甲醛或0.500mL/L终浓度的BPL为宜;3种疫苗均为白色状乳液,4°C下保存期均可达12个月,单价疫苗的最小免疫剂量为100μL/羽,双价疫苗的最小免疫剂量为250μL/羽;免疫抗体水平监测结果表明,免疫后第4周抗体水平达到峰值,且在免疫后第8周仍维持较高水平;免疫攻毒试验结果显示,3种疫苗的保护率均为100%,能完全抵抗病毒攻击;田间试验结果表明,在免疫初期3种疫苗抗体均达到预期免疫效果,免疫保护期在6个月以上,在生产中使用双价疫苗可以减少注射次数。【结论】FAV-4、FAV-8双价油乳剂灭活苗免疫效果好、保存期长、安全性好,为净化I群禽腺病毒提供了技术支撑。

我国Ⅰ群禽腺病毒主要流行血清型hexon蛋白序列分析及抗原表位预测

为了解我国Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)主要流行血清型hexon蛋白序列和抗原表位的差异,对43株FAdV-Ⅰ分离株的hexon进行了序列和遗传进化分析,利用DNAStar中Protean预测了4个流行血清型代表株hexon蛋白的抗原表位。结果显示:同型分离株间hexon氨基酸序列同源性高,其中FAdV-4分离株的氨基酸序列同源性为100%。hexon蛋白氨基酸序列在第132～289位、第363～507位和第793～878位存在3个主要可变区,分别对应于hexon的L1、L2和L4区。在FAdV-11中,分离株QDPD100808和YTLY081010氨基酸序列在第97-138位区段发生缺失,分离株HNQX120913在第693-720位突变为HVQEHERALRHVHQLARERPVASTQPVS。预测到FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11的代表株hexon蛋白分别有40、37、38和37个抗原表位,FAdV-4的特异性抗原表位最多,为16个,FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11特异性抗原表位较少,分别为3个、6个和3个。研究结果为我国FAdV-Ⅰ主要流行血清型基于hexon基因的诊断提供了理论依据。

鸡Ⅰ群禽腺病毒血清4型油乳剂灭活疫苗的研制

为研制鸡Ⅰ群禽腺病毒血清4型(FAdV-4)油乳剂灭活疫苗,试验采用鸡肝癌细胞(LMH)扩增FAdV-4,测定FAdV-4最佳灭活条件和疫苗最佳油水比,研制了FAdV-4油乳剂灭活苗。按《中华人民共和国兽药典》进行疫苗质量、安全性和临床效力检验。结果显示:LMH细胞接种FAdV-4 72h后其毒力最高,TCID50=10-7.78/0.1mL;终浓度0.15%的甲醛溶液37℃24h可灭活FAdV-4;油水比为2∶1的疫苗性状最稳定,质量和安全性检验均合格;疫苗最小免疫剂量为0.4 mL/只;抗体水平在免疫后第2周开始上升,第4周达到最高,而后缓慢下降。对疫苗免疫鸡14 d后注射0.2 mL FAdV-4病毒液(含10-5.78TCID50/0.1 mL),经14 d观察可见鸡全部存活,剖检后无病理变化且攻毒后第3、5、7、10、14天PCR检测均为阴性,临床保护率为100%。研究提示:LMH细胞可有效提高FAdV-4毒价,通过优化FAdV-4灭活条件和疫苗油水比,所研制的疫苗安全性高,保存期长,能有效预防FAdV-4感染,为鸡心包积液综合征防控提供参考。

Ⅰ群4型禽腺病毒特异性SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立Ⅰ群4型禽腺病毒特异性SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,参考Gen Bank中已发布的禽腺病毒的六邻体基因(Hexon)序列设计两对引物,通过PCR扩增出Hexon基因的954 bp目的片段,克隆至p MD-19T载体,提取阳性质粒测定浓度,10倍系列稀释作为荧光定量PCR的标准品模板,制备标准曲线。结果显示,荧光定量PCR熔解曲线峰值单一,产蛋下降综合症病毒(EDSV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽白血病病毒(ALV)等外源病毒均无扩增曲线出现,对标准品模板最低检出值为1.2×101拷贝/μL。对7份Ⅰ群4型禽腺病毒的细胞培养物的检出率为100%,表明建立的实时荧光定量PCR检测方法准确可行。

Ⅰ群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法的建立

利用纯化的 Ⅰ 群禽腺病毒4型重组Hexon蛋白,通过各反应条件筛选,建立了 Ⅰ 群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法.结果显示,抗原最佳包被浓度为1μg/mL;最佳封闭液为1% 牛血清白蛋白;待检血清最佳作用浓度是400倍稀释,37℃孵育60 min;酶标抗体的最佳作用条件为稀释度1:8000,37℃孵育60 min;最佳显色时间为10 min.用所建方法对160只临床鸡只进行检测,同时与拭子PCR检测对比,一致性较好,表明该方法可有效用于临床检测.

广西某健康鸡群Ⅰ群禽腺病毒的hexon蛋白loop 1基因遗传进化分析

为调查广西某规模化鸡场健康鸡群Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)的感染情况,于2017年11月-2018年12月采集不同日龄鸡群咽喉拭子和泄殖腔拭子样品4700份,对样品进行FAdV-Ⅰ检测和hexon蛋白loop 1基因扩增,应用LaserGene7.1和MEGA4.1软件对loop1基因序列进行核苷酸和遗传进化分析。结果显示,FAdV-Ⅰ的阳性检出率为8.72%;40~70日龄和71~99日龄鸡群阳性FAdV-Ⅰ的检出率分别为28.17%和22.91%;测序获得的38条loop 1基因序列分析表明该鸡场健康鸡群感染了5个不同种的FAdV-Ⅰ,其中26.32%的序列为A种(FAdV-A)、2.63%为B种(FAdV-B)、10.53%为C种(FAdV-C)、39.47%为D种(FAdV-D)和21.05%为E种(FAdV-E);遗传进化分析表明该鸡场健康鸡群主要感染的种为FAdV-D,血清2型(FAdV-2)为优势血清型,其次为A种的血清1型(FAdV-1)和E种的血清8a型(FAdV-8a)和8b型(FAdV-8b)。结果表明,40~70日龄健康鸡群的FAdV-Ⅰ的检出率最高,在健康鸡群中感染的FAdV-Ⅰ主要为FAdV-D种中的FAdV-2。

I群禽腺病毒江苏分离株(FAVI-JS)的分离鉴定

通过形态学、致细胞病变和序列比较等对一株疑为I群禽腺病毒江苏分离株FAVI_JS进行了鉴定 ,试验结果表明 :该病毒为球形、无囊膜、二十面体对称 ,直径为 70nm～ 80nm ;不具有凝集鸡、鸭、鹅红细胞的能力但可以凝集大鼠红细胞。在鸡胚肾细胞 (CEK)上可致细胞变圆 ,折光性增强等病变 ;通过PCR方法扩增出的FAVI_JSL、R、ITR三个片段 ,经过测序分析并与GenBank上发表的属于血清I型的CELO病毒、FAV_1、FAV_A和血清 8型的禽腺病毒 (FAV_8)全基因组的相应序列比较 ,FAVI_JS与I群禽腺病毒各毒株在三个片段上同源性都很高 ,其中与血清I型的同源性高达 96 %以上 ,在根据对遗传上具有重要意义的ITR序列绘制的遗传进行树分析 ,FAVI_JS与Ⅲ群禽腺病毒EDS、Y81G4株明显属于不同的分支 ,而与群禽腺病毒 ,特别是与血清I型的禽腺病毒更接近 ,这些结果证明 。

Ⅰ群禽腺病毒FAdV-4和FAdV-8灭活疫苗的制备及免疫效果

为提高鸡心包积液-肝炎综合征(hydropericardium hepatitis syndrome,HHS)和鸡包涵体肝炎(inclusion body hepatistis,IBH)疾病的防控能力,研制有效防控Ⅰ群禽腺病毒(FAdV)疫苗。本研究将实验室分离鉴定的FAdV-4 SN2016株和FAdV-8标准毒株,采用鸡胚增殖方式,优化最佳接种剂量、收获时间及甲醛的灭活条件,病毒抗原以3∶1比例混合,制备双价油乳剂灭活疫苗,检验疫苗性状、监测免疫后雏鸡的抗体水平及对其免疫保护效果。病毒采用卵黄囊接种,尿囊液中病毒粒子含量分别达到4.6×10^8和7.8×10^7拷贝/mL;灭活条件为终浓度1.5‰的甲醛灭活24 h;制备的疫苗为油包水剂型,物理性状稳定,无菌检测合格,4℃保存期可达12个月;雏鸡免疫抗体水平监测结果显示,免疫后3~4周抗体水平达到高峰,第6周依然维持较高水平,制备的双价油乳剂灭活疫苗可以有效抵抗单病毒和双病毒的攻击。研究结果显示制备的FAdV-4 SN2016和FAdV-8双价油乳剂灭活疫苗性状稳定、保存期长,免疫效果好,能有效抵抗病毒攻击,为HHS和IBH疫病的防控提供有效手段。

基于抗原蛋白Fiber-2及细胞因子佐剂的Ⅰ群4型禽腺病毒亚单位疫苗的开发

为了开发一种抗I群4型禽腺病毒(FAd V-4)的亚单位疫苗,选择I群禽腺病毒血清4型流行毒株衣壳蛋白Fiber-2作为保护性抗原蛋白。利用昆虫细胞-杆状病毒系统生产Fiber-2蛋白,通过Westernblot检测重组蛋白的表达情况,利用双向琼脂扩散法检测重组Fiber-2的免疫原性。为了增强亚单位疫苗的免疫保护效果,添加鸡源白细胞介素2(chIL-2)和鸡源γ-干扰素(ch IFN-γ)作为免疫佐剂,与重组Fiber-2单独或混合使用,制备多种形式的亚单位疫苗,并进行动物攻毒保护试验。重组蛋白的Western-blot鉴定结果显示,63 ku处出现Fiber-2蛋白目的条带;双向琼脂扩散试验结果显示,重组蛋白效价达到1∶128,表现出良好的反应原性。动物攻毒保护试验结果显示,单独使用Fiber-2免疫SPF鸡,在50 μg/只的剂量下,可为SPF鸡提供100%的保护效果,以chIL-2和chIFN-γ为免疫佐剂,与重组Fiber-2联合免疫SPF鸡,可显著增强Fiber-2在低剂量(10 μg/只)下的免疫保护效果,上述结果表明重组Fiber-2联合chIL-2和chIFN-γ细胞因子佐剂所制备的亚单位疫苗在抗I群4型禽腺病毒感染领域具有良好的应用前景。

禽安卡拉病毒Hexon蛋白多克隆抗体的制备

为进一步建立Ⅰ群血清4型禽腺病毒（FADV-4）的特异性检测方法,根据本实验室分离鉴定的安卡拉病毒的基因组序列,设计针对六邻体蛋白（Hexon）基因的特异性引物,经PCR扩增,连接至p ET-28a中,构建原核表达载体p ET-28a-Hexon。将其转化感受态BL21中,经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,SDS-PAGE分析,获得重组蛋白大小为49 ku。Western blot分析纯化后重组蛋白能与FAd V-4阳性血清发生特异性反应。将纯化后的重组蛋白免BALB/c小鼠,制备了六邻体蛋白多克隆抗体,采用间接ELISA方法测定效价表明制备的血清效价大于1∶64 000。