黄姑鱼(Nibea albiflora)gsdf基因的克隆及表达分析

为探索gsdf(gonadal soma derived factor)基因对黄姑鱼性别分化和性腺发育的作用,克隆了黄姑鱼gsdf基因ORF序列全长,并运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了该基因在黄姑鱼不同组织和不同发育时期性腺中的表达情况。结果显示:黄姑鱼gsdf基因开放阅读框长648 bp,可编码215个氨基酸,含有TGF-β超家族的保守功能结构域;组织表达分析结果显示,黄姑鱼gsdf基因主要集中在精巢中表达;在23℃左右水温下,孵化后40 d的遗传雄性鱼苗性腺中开始检测到gsdf基因有明显表达(此时组织学上尚看不出精巢形态),49 d后表达量迅速升高,孵化120 d后(精巢分化完成)表达量达到高峰,随后表达量开始下降,直到黄姑鱼精巢成熟之后呈现稳定表达。上述结果提示,黄姑鱼gsdf基因与黄姑鱼性别决定和分化发育过程密切相关。

大黄鱼gsdf和amh基因的克隆及表达分析

该研究克隆了大黄鱼(Larimichthys crocea)gsdf(gonadal soma derived factor)和amh(anti-Müllerian hormone)基因的开放阅读框序列并对它们的表达进行分析。大黄鱼gsdf基因c DNA序列开放阅读框长为618 bp,可编码205个氨基酸,含有信号肽和TGF-β结构域。系统进化分析显示,大黄鱼Gsdf与其他鱼类Gsdf聚为一枝,而与TGF-β超家族其他成员分开。Amh基因c DNA序列开放阅读框为1 563 bp,可编码520个氨基酸,含有信号肽、AMH-N区域和TGF-β保守结构域。系统进化分析显示,大黄鱼Amh与舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)Amh进化关系最近。荧光定量PCR表达分析显示,gsdf和amh基因主要在大黄鱼性腺表达,在精巢中的表达量显著高于卵巢(P<0.05),2个基因都在性腺分化前开始表达,在雄鱼精巢中表达量呈现先升高后下降的趋势,在卵巢的表达量很低。此外,相比于正常雌鱼,gsdf和amh基因在伪雄鱼(遗传性雌鱼)性腺中的表达量显著上调。这些结果表明,gsdf和amh基因在大黄鱼性腺分化过程中起到重要的作用。

斑马鱼Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)质粒的构建及验证

为研究性腺体衍生因子基因(gsdf)在斑马鱼Danio rerio精巢发育过程中相关分子调控机制模型,提取了斑马鱼精巢总RNA,逆转录合成c DNA,并以其为模板,用RT-PCR法扩增得到gsdf基因,构建了以小鼠gamma-crystalin启动子启动的斑马鱼gsdf基因与增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)融合的荧光素酶报告质粒Tg (Crystal-pro-gsdf-2A-egfp),采用显微注射技术注射该质粒至1细胞期的斑马鱼受精胚胎中。结果表明:在荧光显微镜下观察到19尾能在眼部晶状体中特异表达绿色荧光蛋白基因(gfp)的F0代斑马鱼,将表达了绿色荧光蛋白基因的斑马鱼同野生型(WT)非转基因斑马鱼杂交,最终获得能特异表达绿色荧光蛋白基因的F2代,且gsdf基因能在斑马鱼眼部晶状体中特异表达并稳定遗传。研究表明,在斑马鱼上建立的Tg (Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)转基因品系,为研究和观察斑马鱼精巢发育的分子调控机制提供了新的方法。