一种适用于产朊假丝酵母的基因敲除系统及其在gsh1基因敲除中的应用

报道一种适用于产朊假丝酵母Candida utilis的基因敲除系统,利用该敲除系统获得gsh1基因敲除杂合突变株。根据不同种属酵母菌γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)蛋白质的保守序列,克隆C.utilis SZU 07-01的gsh1基因;以商品化质粒pPICZalpha A为基础,构建gsh1基因的敲除载体pPICZalpha A-kan 3,其中,kan基因的启动子TEF被替换为来自于C.utilis SZU 07-01的GAP启动子(pGAP:kan)。质粒电转化C.utilis,获得gsh1基因敲除杂合突变株C.utilis GSH-6。结合发酵培养得到的数据进行分析,突变株的γ-GCS酶活比出发菌株降低17.5%,GSH合成量降低61%,细胞干重降低18.5%。所构建敲除组件pGAP:kan的成功应用为从分子水平研究C.utilis中谷胱甘肽(GSH)的生理功能提供了一种新借鉴。

原生质体诱变选育高产谷胱甘肽菌株及基因表达分析

以Saccharomyces cerevisiaeY518为出发菌株,通过原生质体诱变提高产谷胱甘肽的能力。结果表明:用0.03mol/L HNO2处理原生质体3min,致死率为85.96%,突变率为6.85%;经过4轮连续的HNO2诱变,筛选得到一株胞内谷胱甘肽产量(14.85mg/g干质量)约比出发菌株高24%的突变株。进一步研究谷胱甘肽合成相关的基因表达量,发现其合成途径编码限速酶的基因GSH1的表达量上调了2.26倍。因此,突变株胞内谷胱甘肽水平的提高可能是由上调的GSH1的表达量导致的。