黄颡鱼源维氏气单胞菌Aha和gyrB基因双重PCR检测方法的建立

为建立一种快速、准确检测黄颡鱼源维氏气单胞菌(A.veronii)的方法,本研究根据A.veronii菌株RC110724黏附素基因(Aha)和促旋酶B亚单位基因(gyrB)序列设计引物,经条件优化建立了A.veronii的双重PCR检测方法。结果显示该方法可以同时扩增出A.veronii 419 bp和745 bp两条特异性的片段,而对嗜水气单胞菌、迟缓爱德华菌、副溶血性弧菌、麦氏弧菌、荧光假单胞菌、金黄色葡萄球菌、柱状黄杆菌、肺炎克雷伯氏菌、无乳链球菌、舒伯特气单胞菌扩增结果为阴性;该方法对A.veronii标准株ATCC35624和RC110724基因组DNA和菌体检测下限分别为6.6×10^(-3)ng/μL和3.2×10~2cfu/mL。利用建立的双重PCR方法对30份临床样品进行检测,结果与细菌传统分离鉴定符合率为100%。同时,双重PCR可以检出菌株RC110724人工感染的黄颡鱼肝、脾和肾组织中的细菌DNA,对肝和脾脏组织的样品检测效果最好。本研究建立的双重PCR检测方法特异性好,具有较高的检测灵敏性,可用于黄颡鱼等A.veronii感染病例的快速诊断和流行病学监测。

耐环丙沙星鲍氏不动杆菌的gyrA基因及parC基因突变分析

目的研究本地区临床分离鲍氏不动杆菌环丙沙星耐药表型与DNA旋转酶A亚单位gyrA基因及拓扑异构酶ⅣparC基因突变的关系。方法收集28株耐药株及2株敏感株,通过PCR扩增其gyrA基因及parC基因,并对扩增产物进行限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)及DNA序列分析。结果敏感株的gyrA基因产物经HinfⅠ酶切后可产生两个片段,耐药株则产生1个片段;而parC基因产物经HinfⅠ酶切后,敏感株及耐药株均产生两个片段;DNA测序显示,5株耐药株gyrA基因存在Ser83→Leu及Ala88→Thr突变,其中Ser83→Leu的突变是导致HinfI酶切位点消失的原因,而1株敏感株无突变;1株敏感株与1株耐药株的pcrC基因存在Ser108→Ile突变,另外14株耐药株存在多位点同义突变。结论与parC基因相比,gyrA基因突变是鲍氏不动杆菌对环丙沙星耐药的主要分子基础,环丙沙星的高水平耐药可能需要多种不同的突变。

福氏志贺菌gyrA和parC基因QRDR序列的测定与同源性分析

测定了我国痢疾流行病原志贺菌福氏2 a 3 0 1株与喹喏酮类药物耐药性相关的 gyr A( DNA旋转酶 A亚单位 )和 par C(拓扑异构酶IVA亚单位 )基因 ,并将 gyr A和 par C基因QRDR(喹喏酮类药物耐药性决定区 )核苷酸序列与几种动物和人的病原菌进行了同源性和遗传进化比较分析。结果显示 ,志贺菌福氏 2 agyr A和 par C基因 QRDR序列分别与宋内氏志贺菌、大肠杆菌 O1 57、大肠杆菌 K1 2、阴沟肠杆菌、坂口肠道杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、肺炎克氏杆菌、产道克氏杆菌、空肠弯曲杆菌、弗氏柠檬酸杆菌具有显著同源性(均大于 88% ) ,表明 gyr A和 par C是这些细菌中的看家基因 ,推测在各种细菌中具有类似的起源 ,因此对在不同细菌之间进行喹喏酮类药物耐药性的研究非常有利。 QRDR的遗传进化分析表明 ,同属或相近属细菌 gyr A或 par CQRDR的遗传距离明显接近 ,其中与大肠杆菌属的距离最近 ,认为可列到同一个属 ,结果有力支持了近年提出的大肠杆菌与志贺菌属于同族细菌的理论。

耐氟喹诺酮类药物的大肠埃希菌gyr A 基因点突变检测

目的：研究大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制。方法：对大肠埃希菌标准菌４４３０２和临床收集的３株对氟喹诺酮类药物高度耐药的大肠埃希菌及１株敏感菌，用ＰＣＲ方法扩增ＤＮＡ旋转酶ｇｙｒＡ基因的Ｎ末端编码区，并进行克隆和序列测定。结果：对氟喹诺酮类药物高度耐药的大肠埃希菌的ｇｙｒＡ基因的序列分析，发现３个导致氨基酸改变的基因点突变：丝氨酸－８３→亮氨酸；丙氨酸－８４→脯氨酸；天冬氨酸－８７→天冬酰氨。结论：对氟喹诺酮类药物高度耐药的大肠埃希菌的ＤＮＡ旋转酶Ａ亚单位存在着基因点突变。

肠道病原菌gyrB基因系统发育分析

[目的]探讨gyrB基因区分鉴别肠道病原菌的能力,为临床快速鉴定病原菌提供依据。[方法]通过PCR扩增及测序方法,获得肠杆菌科和弧菌科的14种临床常见肠道病原菌gyrB基因序列,合并采集来自GenBank的标准菌株序列,采用距离法构建系统发育树。[结果]在系统发育树的拓扑结构中,除志贺氏菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌外,同一菌种的不同菌株均聚类形成具有较高的自举支持率单系类群。大肠杆菌演化支内混杂有志贺氏菌分支;嗜水气单胞菌的临床分离株与标准菌株相距较远,未能聚类成单系类群。另外,除乙型副伤寒沙门氏菌外,其余沙门氏菌gyrB序列在血清型水平呈现高度同源性,使得5种血清型各自聚类区分。[结论]采用gyrB基因作为肠道病原菌系统发育分析靶基因是合适的,其可以在菌种水平区分包含肠杆菌与弧菌科的肠道病原菌。

用gyrB、rpoD基因扩增测序进行气单胞菌分类的探讨

目的获得气单胞菌更准确的分类结果。方法收集经Vitek全自动细菌分析仪及配套的GN鉴定卡鉴定为气单胞菌的菌株231株,对其gyr B、rpo D两个管家基因进行PCR扩增及测序,并与Gen Bank中标准序列进行基因序列比对和单核苷酸替代率分析,综合分析gyr B、rpo D两基因测序结果并进行基因分类。结果 231株气单胞菌中,69株(29.9%)gyr B和rpo D基因均获得测序结果,86株(37.2%)仅获得gyr B序列,50株(21.6%)仅获得rpo D序列,26株(11.3%)两种基因均未获得序列。生化表型鉴定为嗜水气单胞菌的菌株中62.7%基因分类结果为达卡气单胞菌,仅22.4%为嗜水气单胞菌,其种间生化反应结果相近。结论气单胞菌属的生化分类与基因分类结果存在差异。达卡气单胞菌与嗜水气单胞菌的鉴定依赖于基因序列分析。

GYR和GYP对酵母发酵液中RNA和蛋白质的影响

测定酵母发酵液中核糖核酸和蛋白质的含量表明，在ＧＹＲ培养基中的发酵液核糖核酸和蛋白质的含量比在ＧＹＰ发酵液中的含量高，且随着培养天数的延长而逐渐增多，培养４ｄ后，ＧＹＲ中发酵液的核糖核酸和蛋白质含量分别是ＧＹＰ含量的３．７３倍和１．５３倍。

结核分枝杆菌喹诺酮类药物耐药与gyr基因突变的初步研究

目的初步了解福建省结核分枝杆菌分离株喹诺酮类药物耐药性与gyr基因突变的关系。方法对来源于福建省结核病耐药性监测30个监测点纳入的75株耐多药结核分枝杆菌分离菌株,行包含gyrA、gyrB基因喹诺酮类药物耐药决定区(QRDR)序列测定,以结核分枝杆菌H37Rv标准株DNA序列为参比序列进行比较分析。结果 75株耐多药结核分枝杆菌中,56株氧氟沙星敏感株均未检测到gyrA基因发生突变,19株氧氟沙星耐药株检测到16株(84.21%,16/19)gyrA基因发生突变,其中9株突变发生在第91位密码子,4株发生在第94位密码子,3株发生在第95位密码子,发现Ser95Asn为新突变类型;所有菌株均未检测到gyrB基因发生突变。结论 gyrA基因突变是耐喹诺酮结核分枝杆菌耐药性的主要分子机制;gyrA基因的突变主要发生在第91位、94位、95位密码子上。

香蕉枯萎和细菌性软腐病菌的多重PCR检测

香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense和细菌性软腐病菌Dickeya zeae的复合侵染为害给香蕉产业发展带来严重挑战,有必要建立相关病害的多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction, multiplex PCR)检测技术。本文基于尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种(F.oxysporum f.sp.cubense race 1,FOC1)基因组contig 438区间(35 631-37 693 bp)(GenBank:AMGP01000438.1)和4号生理小种(F.oxysporum f.sp.cubense race 4,FOC4)基因组contig 195区间(4 028-6 126 bp)(GenBank:AMGQ01000195.1)存在160 bp插入序列差异设计特异扩增引物FOC-F/-R,同时以香蕉细菌性软腐病菌D.zeae的促旋酶B亚单位基因(the subunit B of gyrase gene)(GenBank:JQ284039)序列设计特异扩增引物gyrB-F/-R。多重PCR检测结果显示:本技术可在一次PCR扩增反应内同时检测香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种和细菌性软腐病菌;多重PCR的灵敏度结果表明:检测香蕉枯萎病菌的DNA浓度最低限为0.1 ng/μL,细菌性软腐病菌的灵敏度为103cfu/mL;检测结果稳定可靠。因此,本研究建立的多重PCR检测方法可有效应用于检测香蕉发病组织中的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌,也可用于香蕉种苗和田间土壤带病菌的监测,为香蕉种植保驾护航。

我国南方地区鱼源气单胞菌不同种类的流行特征

为加深对我国南方地区养殖鱼类中不同种类气单胞菌流行特征的认识,选取2009年至2014年间我国南方地区70口池塘患病的草鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲫鱼、鳜鱼、斑点叉尾和乌鳢等15种鱼类体内分离的143株气单胞菌为研究对象,通过细菌生理生化特征分析以及保守基因gyr B和rpo D的序列测序分析进行病原菌的鉴定,143株气单胞菌中有维氏气单胞菌80株,嗜水气单胞菌40株,简氏气单胞菌9株,舒氏气单胞菌10株和水生气单胞菌4株。调查分析结果表明,近年来我国南方地区养殖鱼类气单胞菌病的病原具有较高的种类多样性,其中维氏气单胞菌(80/143,56%)的出现比例最高,该菌主要感染草鱼、鲢鱼和鳜鱼等;嗜水气单胞菌次之(40/143,28%),其主要感染鳙鱼、团头鲂和斑点叉尾等;简氏气单胞菌(9/143,6%)亦常常在感染的草鱼、鳙鱼、广东鲂和锦鲤等鱼类中检出;目前,舒氏气单胞菌(10/143,7%)的感染宿主则较为单一,仅在患病乌鳢中分离得到该病原;水生气单胞菌(4/143,3%)目前仅在患病美国红鱼中发现。研究结果表明,我国南方地区鱼类气单胞菌败血症主要是由维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌感染引起,并且常出现这两种菌的复合感染。本研究将为我国南方地区养殖鱼类气单胞菌病的流行病学分析、疾病预防和治疗奠定理论基础。

海南罗非鱼致病性维氏气单胞菌分离鉴定及药敏特性研究

2014年3—5月海南省罗非鱼主养区多个养殖场发生爆发性疾病,从患病尼罗罗非鱼不同组织中分离获得12株优势菌。经人工回归感染试验,从肝脏和脑中分离获得的HN-G-03和HN-B-02菌株具较强的致病力,HN-G-03和HN-B-02菌株对罗非鱼的的半致死密度分别为7.12×105cfu/尾和1.32×105cfu/尾。经16S rRNA和gyr B基因序列分析,同时结合细菌的形态学特征、生理生化特征,菌株HN-G-03和HN-B-02分别被鉴定为维氏气单胞菌的维氏生物型和温和生物型。体外药物药敏试验结果显示,两株菌均对左氧氟沙星、强力霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、庆大霉素等5种药物高度敏感,对呋喃妥因等3种药物中度敏感,对青霉素等12种药物较强耐药。

嗜水气单胞菌喹诺酮类药物抗性决定区基因片段的克隆与突变分析

将分离到的4株对环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星等喹诺酮类药物耐药的嗜水气单胞菌、2株敏感菌,进行旋转酶基因A亚单位(gyrA)喹诺酮抗性决定区基因(QRDR)PCR扩增。引物序列A1:AGAGTTC CTATCTTGATTACG;A2:CTGTGATGTAGGTCATCAACT,在gyrA基因中的位置分别为53～73和620～640。PCR扩增后,将扩增产物克隆到pMD-18T载体,酶切鉴定后测序。用DNAstar软件分析比较其蛋白序列,发现4个氨基酸突变位点,分别是83位点的Ser-Ile(4株耐药菌),92位点的Leu-Met(4株耐药菌),174位点的Ile-Phe(3株耐药菌),202、203位点的Asn、Leu-Asp、Arg(3株耐药菌,另1株Leu未突变),83位点的突变与大肠杆菌等一致,122位点具有保守的Try,耐药菌突变后的氨基酸残基分子量均比对应增大。4株耐药菌、2株敏感菌的喹诺酮抗性决定区基因片段序列已登录GenBank,注册号AY039655,AY039656,AY138539,AY138540,AY138537,AY138538。

应用PCR方法检测蜡样芽胞杆菌的研究

采用PCR技术,通过扩增蜡样芽胞杆菌的gyrB基因来实现对蜡样芽胞杆菌的快速检测。结果表明,以gyrB为目的基因设计引物建立的PCR检测方法能特异性地扩增出蜡样芽胞杆菌,且与其他芽胞杆菌菌株均无交叉反应,其检测敏感性可达9 cfu/mL,能够应用于蜡样芽胞杆菌的鉴定。

副溶血性弧菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立

以副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)gyr B基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增(Real-time fluorescence single primer isothermal amplification,实时荧光SPIA)检测副溶血性弧菌的方法。实时荧光SPIA在40 min反应时间内,对3株副溶血性弧菌和16株其他食源性致病菌进行实时荧光SPIA检测,结果表明除3株副溶血性弧菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌纯培养DNA的灵敏度为8.2 fg/μL,对副溶血性弧菌菌悬液的检测灵敏度为13.5 CFU/m L;对鳕鱼、海蟹、牡蛎和咸鸭蛋等4种模拟样品中副溶血性弧菌的检出限均为14.7 CFU/g。研究结果表明,实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便。

健康人群肠道大肠埃希菌对氟喹诺酮药物的耐药性及耐药机制研究

目的 研究健康人群（2周内未使用过抗菌药物）肠通分离的110株大肠埃希菌对4种氟喹诺酮类抗菌药物的耐药性及耐药机制。方法 用琼脂稀释法测定4种氟哇诺酮类抗菌药物对110株大肠埃希菌的最低抑菌浓度（MIC）。用聚合酶链反应扩增gyrA、parc基因．序列分析明确其突变情况．并与28株2周内使用过抗菌药物病人肠道分离的菌株进行比较。结果 大肠埃希菌对4种氟喹诺酮类抗菌药物的耐药率未用药组为12．7％-15．5％，用药组为20．8％-25．0％。测序发现60号敏感菌株没有任何氨基酸突变。11株耐药菌中，gyrA基因编码的氨基酸均存在83传突变。即ser83→Leu；其中8株存在双突变，即同时AsD87→Ash：6株存在3个突变，还包括Clu214→Gly。parC基因编码的氨基酸中，有8株存在Ser80→Ile突变，另有2株存在Glu84→Gly突变。结论 健康人群肠道大肠埃希菌对4种氟喹诺酮类抗菌药物的耐药率为12．7％-15．5％，主要山gyrA基因和parC基凶位点突变造成，以gyrA基因为主。

某铁矿中白钨的综合回收试验研究

对某铁矿磁选尾矿中白钨矿进行了探索性选矿试验研究。试验表明:采用碳酸钠作pH调整剂,水玻璃做抑制剂,GYR作为捕收剂,闭路浮选获得含WO3品位61.92%,回收率74.82%的指标。该工艺流程所获指标较高,且工艺流程稳定可靠、药剂制度简单、生产易于实现。

黄瓜白粉病的生防细菌筛选及鉴定

为开发黄瓜白粉病的生防资源,与三七根腐病菌、禾谷镰刀菌和柑橘炭疽病菌进行平板对峙培养,从25株黄瓜根际土细菌和91株烟草内生细菌中筛选出具拮抗功能的菌株;以盆栽试验从拮抗功能菌株中筛选能够防治黄瓜白粉病的生防菌株;用PCR扩增生防菌株的gyr B基因,结合菌株的菌落形态和部分生理生化特征,确定生防菌株分类地位。结果表明,在116株对峙培养细菌中,18株对三七根腐病菌、禾谷镰刀菌和柑橘炭疽病菌有较好拮抗效果。在盆栽试验中,烟草内生菌YN-201490和黄瓜根际菌株WL-1对黄瓜白粉病防效较好,其中YN-201490的1.81×108cfu/m L和WL-1的1.6×108cfu/m L稀释液连续施用3次后的防效分别达64.86%和61.26%。最终YN-201490被鉴定为枯草芽孢杆菌,WL-1被鉴定为解淀粉芽孢杆菌。

花斑副沙鳅源致病性维氏气单胞菌的分离、鉴定及药物敏感性分析

为了对引起养殖花斑副沙鳅(Parabotia fasciata Dabry)幼鳅死亡的分离菌株(XQS1)进行鉴定,本研究对其进行了生理生化分析、16S rRNA基因和gyr B基因序列测定及系统进化树分析。结果显示,该致病菌与维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)形态特征以及生理生化特性相似,通过对其16S rRNA基因和gyr B基因序列比对及进化树分析,显示该菌株与GenBank中维氏气单胞菌相关基因序列的一致性均在98%以上,而且在系统进化树中与维氏气单胞菌聚为一簇,综合以上结果确定该致病菌为维氏气单胞菌。溶血性分析和毒力基因检测结果显示,菌株XQS1能够使兔血平板呈β溶血,并携带了act、alt、aer、hlyA毒力基因,进一步证实了该菌株具有较强的致病性。药敏结果显示,该菌株对多西环素、诺氟沙星、氧氟沙星、氟苯尼考等药物敏感,而对其它药物中度敏感或耐药。本研究首次报道了维氏气单胞菌对人工养殖花斑副沙鳅的危害,并为临床上该病的防治提供了药物参考,对花斑副沙鳅产业化养殖具有重要意义。

聚合酶链反应RFLP与SSCP检测伤寒杆菌DNA旋转酶基因变异

DNA旋转酶为喹诺酮类抗菌药物作用靶位 ,其变异为细菌耐药主要原因之一。本文利用 PCR-RFL P、SSCP对伤寒杆菌 2 75 (临床分离敏感株 )及其自发耐药突变株 RG1 DNA旋转酶 A亚单位基因 (gyr A)耐喹诺酮类决定区进行检测 ,并以 DNA序列分析对该变异进行检测。结果表明 ,与伤寒杆菌 2 75相比 ,RG1 gyr A第 2 47位由 T变异为 G,相应于 DNA旋转酶 A亚单位第 83位氨酸由丝氨酸变为丙氨酸。Hinf 对PCR产物酶切分析表明有一 GANTC序列变异 ,SSCP则发现伤寒杆菌 2 75与 RG1 DNA电泳图象有明确差异。结果表明 PCR- RFL P、SSCP检测伤寒杆菌 gyr A变异快速、特异和灵敏。

陀螺仪安装误差的测量方法研究

介绍了一种用于测量平台式惯性导航系统陀螺安装误差的陀螺轴扰动技术 .该技术无需增加惯导系统的硬件设施 ,通过对平台框架施加特定的控制力矩 ,使其按照要求的规律运动 ,然后采集有关的数据并通过适当的算法即可得到陀螺的安装误差角 .理论分析和仿真结果表明 。