丙戊酸诱导白血病HL-60细胞凋亡及其对h-tert基因表达的影响

为了探讨丙戊酸(valproic acid,VPA)对白血病HL-60细胞诱导凋亡的作用及其可能的机制,采用细胞毒性试验(CCK-8法)观察不同浓度VPA在不同作用时间对HL-60细胞增殖的影响,采用荧光显微镜检及流式细胞术检测细胞凋亡,并观察VPA作用后HL-60细胞端粒酶亚单位h-tert基因、凋亡相关蛋白表达和caspase-3活性的变化。结果表明:VPA呈剂量依赖性抑制HL-60细胞增殖(r=-0.87).,诱导细胞凋亡;同时,抗凋亡蛋白BCL-2表达明显下降,促凋亡蛋白BAX表达上调,caspase-3活性增强,h-tert mRNA表达逐渐下降,HL-60细胞的凋亡率与h-tert mRNA表达呈负相关。结论:VPA可抑制白血病HL-60细胞增殖,诱导细胞凋亡;VPA可能通过下调h-tert mRNA、BCL-2蛋白表达,上调BAX表达及增强caspase-3活性而发挥抗白血病作用。

胰腺癌患者外周血循环c-Met和h-TERT表达的临床意义

目的:探讨胰腺癌患者外周血循环肝细胞生长因子受体c-Met和端粒酶亚催化单位(human telomerase reverse tran scriptase,h-TERT)表达的临床意义。方法:联合应用纳米免疫磁珠及巢式PCR方法检测胰腺癌患者外周血循环中c-Met和h-TERT的表达以确定微转移是否存在,并探讨其临床意义。结果:胰腺癌患者外周血循环c-Met与h-TERT的表达与性别、年龄、肿瘤大小、血清CA-199及CEA无统计学相关(P>0.05)。不同肿瘤分期间c-Met和h-TERT阳性表达率有显著性差异(P<0.05),外周血c-Met与h-TERT表达阳性患者有肿瘤复发风险,h-TERT阳性患者较c-Met阳性患者肿瘤复发率高(P<0.05)。c-Met表达阳性的患者无瘤生存中位时间为12个月,阴性患者为20个月(P=0.044);h-TERT表达阳性患者无瘤生存中位时间为9个月,阴性患者为15个月(P<0.001)。结论:外周血存在微转移的胰腺癌患者肿瘤复发率高,外周血h-TERT较c-Met表达阳性患者肿瘤复发率高,预后更差。

针对c-myc基因的小干扰RNA对急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞的c-myc、h-tert表达的影响

本研究探讨针对c-myc的小干扰RNA对急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞c-myc,h-tert基因和蛋白表达的影响,为白血病的基因治疗提供新方法和靶点。针对c-myc mRNA的第1545-1565靶位点用化学合成法合成siRNA,经转染剂转染入Jurkat细胞。应用RT-PCR及Western blot分别检测c-myc siRNA作用前后c-myc、h-tert基因的mRNA及蛋白表达的变化。结果表明:c-myc siRNA能明显抑制Jurkat细胞的增殖,作用48小时的半数抑制浓度(IC50)约为75nmol/L。c-myc siRNA可引起Jurkat细胞的c-myc、h-tert mRNA和C-MYC、hTERT蛋白表达水平降低。结论:c-myc siRNA明显降低Jurkat细胞c-myc、h-tert基因的mRNA及蛋白表达水平。c-myc siRNA可能是通过抑制c-myc mRNA表达而降低胞内C-MYC蛋白水平。

联合检测外周血AFP mRNA、h-TERT mRNA对肝细胞肝癌的诊断价值

目的探讨肝细胞肝癌患者外周血AFP mRNA、h-TERT mRNA表达对肝细胞肝癌的诊断价值。方法应用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)定量检测60例肝细胞肝癌患者外周血AFP mRNA、h-TERT mRNA的表达量,并与对照组进行比较。结果肝细胞肝癌患者外周血中的AFP mRNAh、-TERT mRNA表达量比对照组增高,差异有统计学意义(P<0.01)。它们的阳性率分别达到76.7%、83.3%,和对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);联合两个指标进行检测,敏感度提高到92.6%,同时其特异度为97.2%,是诊断肝细胞肝癌的良好肿瘤标志物。其表达结果与肿瘤包膜是否完整、有无肝内浸润和(或)转移明显相关(P<0.05);而与肝癌组织的分化程度、外周血AFP的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论在外周血中定量检测AFP mRNA、h-TERT mRNA表达量可以作为肝细胞肝癌的诊断指标,能够早期发现肿瘤,甚至可以发现其他检测方法尚不能发现的小肝癌,联合检测的意义更为明显。

6-氟-4-羟基-3-氧代-3,4-二氢喹喔啉-1(2 H)-羧酸叔丁酯的合成、晶体结构及抗肿瘤活性研究

喹喔啉类化合物由于具有显著的生物活性而被广泛应用于医药、化工领域,特别是抗癌药物研发领域。本文通过四步反应法首次合成了6-氟-4-羟基-3-氧代-3,4-二氢喹喔啉-1(2 H)-羧酸叔丁酯,经溶液结晶法获得其单晶体。晶体学分析表明,该化合物属单斜晶系,空间群C2/c,晶胞常数a=1.28663(10)nm,b=2.25249(17)nm,c=1.01564(7)nm,Z=8,ρ_(c)=1.359 g·cm^(-3),R=0.0538,R_(w)=0.1406。在B3LYP/6-311+G(2d,p)模式下使用密度泛函理论(DFT)计算了该化合物的最佳结构,与X射线单晶衍射确定的晶体结构基本一致。抗肿瘤活性研究表明其有良好的抗肿瘤作用。此外,通过DFT计算了分子的静电势和前沿分子轨道。

hTERT-TK/GCV联合hTERT-CD/5-FC靶向抗肝癌及旁观者效应机制的研究

目的观察人端粒酶反转录酶-胸苷激酶/丙氧鸟苷(hTERT-TK/GCV)联合hTERT-胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)对肝癌细胞株HepG2生长及凋亡的靶向杀伤效应。方法细胞培养,构建pGL3-hTERT-CD质粒,hTERT-TK/GCV联合hTERT-CD/5-FC同时转染HepG2细胞和正常肝细胞L-02,用噻唑蓝(MTT)法观察药物浓度对肝癌细胞存活率的影响,用DNA缺口末端标记法(TUNEL)观察自杀基因对肝癌细胞生长和凋亡的影响,以及对旁观者效应的观察。结果MTT法显示hTERT启动子驱动下两自杀基因体系可以协同表达于肝癌细胞,当GCV为20μg/ml,5-FC为200μg/ml时,对HepG2细胞的杀伤作用达到最大。TUNEL法显示在肝癌细胞中,自杀基因一被启动子高效表达,产生凋亡小体和明显的细胞凋亡率,转染正常肝细胞无此现象。结论hTERT-TK/GCV联合hTERT-CD/5-FC基因体系能够靶向杀伤肝癌细胞,存在明显的旁观者效应,弥补了基因治疗转染效率不高的问题,便于指导今后的实验和研究。

pcDNA3.1(+)/hTERT-tk真核表达质粒的构建及其在HepG-2细胞中的表达

目的:研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦(HSV-tk/GCV)系统对肝癌HepG-2细胞的体外杀伤作用。方法:构建hTERT基因启动子调控的tk基因真核表达载体pcDNA3.1(+)/hTERT-tk,用脂质体法分别转染肝癌细胞(HepG-2)和正常肝细胞(L-02)后给予更昔洛韦(GCV),用TUNEL法观察自杀基因对肝癌细胞生长的影响。结果:HETRT启动子调控下的HSV-tk/GCV系统对肝癌HepG-2细胞有明显的杀伤作用,而对正常肝细胞则作用不明显。结论:hTERT-tk/GCV基因体系能够靶向杀伤肝癌细胞,有靶向治疗肝癌的潜力。

hAFP及hTERT双启动子调控的针对人IGF-II基因的siRNA特异性抑制人肝癌细胞生长

目的:设计并筛选高效沉默胰岛素样生长因子II(IGF-II)基因的小干扰RNA(siRNA)序列,构建由重组人甲胎蛋白(hAFP)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)双启动子调控的该siRNA表达载体,观察其对肝癌细胞生长的影响。方法:根据siRNA设计原则,参照IGF-II mRNA序列设计3对siRNA序列及1对阴性对照序列,转染人肝癌Huh7细胞,转染24 h后采用实时荧光定量PCR检测IGF-II mRNA表达量变化,筛选干扰效率最高的siRNA序列。采用PCR扩增出hAFP及hTERT启动子的核心序列,应用基因重组技术构建重组hAFP和hTERT双启动子调控的该siRNA表达载体。将上述siRNA表达载体转染Huh7细胞及L-02人正常肝细胞,观察IGF-II mRNA表达及细胞生长情况变化。结果:实时荧光定量PCR显示,siRNA3在25 nmol/L浓度时抑制效率最高,约90%。成功扩增hAFP及hTERT启动子核心序列,将其分别克隆入pGL3-Basic载体,构建成重组pGL3-hAFP-hTERT载体;将siRNA3克隆至pGL3-hAFP-hTERT载体,构建成重组pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3表达载体。Huh7细胞IGF-II mRNA表达量显著降低,抑制效率达86%,细胞增殖受到明显抑制,G1期细胞比例显著增加;L-02细胞上述指标无明显改变。结论:成功构建双重RNA聚合酶II启动子(hAFP及hTERT双启动子)调控的针对IGF-II基因的siRNA表达载体,即pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3;该siRNA表达载体可特异性抑制IGF-II mRNA表达及肝癌细胞生长。

pGL3-hTERT-tk／GCV对胃癌细胞的促凋亡作用

目的:探讨重组质粒pGL3-hTERT-tk/GCV对胃癌细胞的促凋亡作用。方法:以基因工程方法构建重组质粒pGL3-hTERT-tk和相应的荧光报告质粒pGL3-hTERT-tk-Luc^+;脂质体Lipofectamine^(TM)2000瞬时转染胃癌细胞系SGC-7901并用GCV干预,荧光显微镜观察细胞形态变化和转染效率,TUNEL标记和流式细胞术观察转染后胃癌细胞的凋亡;以上实验均以正常肝细胞L-02为对照。结果:经鉴定,重组质粒pGL3-hTERT-tk中tk片段的长度为1100 bp。荧光素酶标记的阳性、阴性对照及治疗报告质粒pGL3-hTERT-tk-Luc^+均能有效转染高表达端粒酶活性的胃癌细胞SGC-7901,转染效率为(8.2±1.14)%。重组质粒转染胃癌细胞后与GCV共育4 d,细胞的凋亡率为(60.0±1.56)%;被pGL3-hTERT-tk转染的肿瘤细胞细胞周期发生了变化,处于细胞周期早期的细胞大量凋亡,早期凋亡率为(47.1±1.35)%。结论:pGIB-hTERT-tk/GCV对胃癌细胞有强烈的杀伤作用,但不影响正常细胞的生长,有潜在临床应用前景。

靶向c-myc基因的siRNA基因干扰对大肠癌Lovo细胞增殖与凋亡的影响

目的阐述靶向c-myc基因的si RNA基因转染干扰对大肠癌Lovo细胞增殖与凋亡的影响作用。方法将靶向c-myc基因的si RNA片段转染入大肠癌Lovo细胞,特异沉默c-myc基因,通过实时荧光定量PCR法检测c-myc m RNA表达水平,原位末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase d UTP nick end labeling,TUNEL)检测肿瘤细胞凋亡情况及噻唑蓝法[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]检测细胞的增殖能力。结果经过转染的Lovo细胞组与未转染的对照组c-myc m RNA表达量比率为0.22∶1,c-myc m RNA表达量比例有统计学差异(P<0.05)。经过转染的Lovo细胞与未转染的对照组的凋亡指数分别为32.4%与65.4%,具有显著性统计学差异(P<0.01)。MTT检测经过转染的Lovo细胞与未转染的对照组的细胞增值率,分别为79.28%与38.32%,具有极其显著性统计学差异(P<0.001)。结论将靶向c-myc基因的si RNA片段转染入大肠癌Lovo细胞,特异沉默c-myc基因,从而证实c-myc抑制大肠癌细胞增殖,诱导细胞凋亡的作用,从而为大肠癌的基因治疗寻求更多的治疗靶点。

5-Aza-C对人鼻咽癌细胞hTERT基因表达及端粒酶活性的影响

目的研究去甲基化药物5-氮杂胞嘧啶核苷(5-Azacytidine,5-Aza-C)对鼻咽癌细胞亚端粒区D4Z4甲基化状态、h TERT基因表达及端粒酶活性的影响。方法常规培养鼻咽癌CNE,CNE1,CNE2及5-8F细胞系。5-Aza-C处理鼻咽癌细胞后,甲基化测序聚合酶链反应(MSP)法检测亚端粒区D4Z4甲基化;RT-PCR检测h TERT m RNA水平;端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplifi cation protocol,TRAP)法检测端粒酶活性。结果 5-Aza-C处理后,四种鼻咽癌细胞系的亚端粒区D4Z4序列的甲基化水平较处理前明显下降。2.5μmol/L 5-Aza-C处理后,四种鼻咽癌细胞h TERT m RNA的表达明显下调,端粒酶活性显著抑制。结论在鼻咽癌的发生中,亚端粒区的DNA甲基化水平紊乱起了一定的作用,去甲基化药物5-Aza-C能下调h TERT表达,抑制端粒酶活性。探讨鼻咽癌细胞中h TERT表达与亚端粒区Cp G岛甲基化状态之间的关系,可能为亚端粒区染色体结构异常在鼻咽癌发生中的作用提供深刻见解。

食管上皮癌变过程中NF-κB与hTERT的表达及其意义

目的检测食管上皮癌变过程中NF-κB与h TERT蛋白表达水平,探讨其与食管鳞状细胞癌(以下简称食管癌)癌变的关系。方法应用免疫组织化学方法检测了45例食管鳞状细胞癌、21例不典型增生和24例切缘正常组织中NF-кB和h TERT蛋白的表达水平。应用SAS统计学软件分析食管癌组织中NF-κB和h TERT蛋白表达的相关性。结果 h TERT蛋白在癌组织中的表达(88.9%)显著高于不典型增生(57.1%)和切缘正常组织(12.5%)(P<0.05),h TERT蛋白表达与患者年龄、性别、淋巴结转移及肿瘤的分化程度无关(P>0.05),与食管癌的浸润深度有关(P<0.01)。NF-кB在癌组织中的表达(80.0%)明显高于不典型增生(57.1%)和切缘正常组织(20.8%)(P<0.05),与患者年龄、性别、淋巴结转移及肿瘤的分化程度无关(P>0.05),与食管癌的浸润深度有关(P<0.01)。统计学分析,食管癌组织中NF-кB与h TERT蛋白表达呈显著正相关(P<0.05)。结论食管癌组织中h TERT及NF-κB表达异常增高可能是引起食管癌变的因素之一,联合检测h TERT及NF-кB蛋白,有助于食管癌的早期诊断及预后判断。

甲苯与叔丁醇在MgO/氢型丝光沸石催化剂上的烷基化反应

以氢型丝光沸石(HM)负载MgO制备了MgO/HM催化剂,在100mL高压釜中进行甲苯与叔丁醇的烷基化反应,考察了MgO负载量和反应条件对甲苯与叔丁醇烷基化反应的影响。采用X射线衍射、NH3程序升温脱附和吡啶吸附红外光谱等方法对催化剂进行了表征。表征结果显示,当MgO负载量(质量分数)为5%时,MgO在HM表面仍高度分散。与HM相比,MgO负载量为0.5%的MgO/HM催化剂的L酸中心数量增多,B酸中心数量减少,催化活性最高;在初始压力0.60MPa反应温度180℃、反应时间3h、n(甲苯)∶n(叔丁醇)∶n(正己烷)=1∶3∶10、m(甲苯)∶m(催化剂)=10的条件下,甲苯转化率为50.72%,对叔丁基甲苯的选择性为77.62%。

c-kit突变型人胃肠间质瘤永生化细胞系的建立与鉴定

目的通过在c-kit突变型人胃肠间质瘤原代细胞中过表达人端粒酶逆转录酶(h TERT),建立c-kit突变型人胃肠间质瘤永生化细胞系。方法利用聚合酶链反应(PCR)技术获得h TERT目的基因片段,测序正确后,体外构建端粒酶亚单位(h TERT)逆转录病毒表达载体,转染c-kit突变型胃肠间质瘤原代细胞,通过RT-PCR及western bloth技术检测h TERT在原代细胞内的表达变化,选取h TERT表达升高的细胞,利用有限稀释法获得高表达h TERT的单克隆细胞株。结果实验中成功获得h TERT目的基因片段,获得的细胞株与原代细胞相比h TERT表达上调,且体外传代50次后依然保持很好的细胞形态及活力。结论成功获得c-kit突变型人胃肠间质瘤永生化细胞系,为进一步研究c-kit突变对胃肠间质瘤的影响奠定基础。

慢病毒载体介导hTERT对肝细胞生物学特性的影响

目的:研究慢病毒介导人端粒酶逆转录酶(h-TERT)基因对人张氏肝细胞(chang liver)生物学特性的影响。方法:将表达h-TERT基因的重组慢病毒感染人张氏肝细胞,通过杀稻瘟筛选获得阳性克隆。分别采用实时荧光RT-PCR、TRAP-PCR及ELISA方法检测转染前后chang liver细胞的h-TERT-mRNA水平和端粒酶活性的变化。通过MTT法、流式细胞术(FCM)观察其形态变化及生长增殖情况。结果:转染后的chang liver细胞存在h-TERT基因过表达和端粒酶活性上调,体外培养条件下维持肝细胞原有形态,存活期显著延长,增殖能力较强。结论:外源性h-TERT基因的异位表达不仅上调chang liver细胞的端粒酶活性,而且促进其增殖。

Gene therapy targeted to telomerase in HCC by AF-hTERT-TK/GCV

Objective： The aim of this study was to observe the affection of targeted therapy to plasmid AF-pGL3-hTERT-TK in HCC cell line HepG2. Methods： We constructed therapeutic plasmid pGL3-hTERT-TK （containing suicide gene TK that promoted by promoter of hTERT） and was conjugated with AF-liposome （a protein that can combine with the receptor ASPGR on HCC cell surface）. Then we transfected HCC cell line HepG2 and hepatic cell L02 with AF-pGL3-hTERT-TK, observed the effects of therapeutic plasmid AF-pGL3-hTERT-TK for HCC cell line growth and apoptosis in vitro by Flow cytometry and Tun- nel method. Results： Our results showed that TK gene was 1100 bp in plasmid pGL3-hTERT-TK. Plasmid pGL3-hTERT-TK can effectively transfect HCC cell HepG2 and the transfection rate was 8.91%. By recognizing and combining effects of recep- tor protein ASPGR on HCC cell surface the therapeutic plasmid AF-pGL3-hTERT-TK could easily enter into HCC cell HepG2 and induce its apeptosis. The apoptosis rate was 85.87% while only 8.65% in L02 cell. Four days after AF-pGL3-hTERT-TK transfected HepG2 was intervention by ganciclovir （GCV）, a lot of apeptotic bodies were found by Tunnel analysis, while little apoptotic body was found in hepatic cell L02. Conclusion： AF-pGL3-hTERT-TK can target to HCC cell line and induce it to apoptesis, almost has no influence on hepatic cell L02. AF-pGL3-hTERT-TK has the potential therapeutic effects for HCC.

端粒酶催化亚单位基因诱导人骨髓间充质干细胞的实验研究

目的利用端粒酶催化亚单位基因(h TERT)异位表达建立永生化人骨髓间充质干细胞(h MSCs)系。方法使用含有h TERT的重组质粒载体转染人原代骨髓间充质干细胞,经新霉素G418筛选,连续传代培养,通过形态学、免疫组织化学及PCR技术等方法对细胞系进行鉴定。结果转染后骨髓间充质干细胞基本保持了原代细胞的表型特征、形态均一、多为梭形,呈漩涡状或放射状排列,有特征性表型。细胞免疫组化染色显示有h TERT的表达。结论成功地构建了h TERT永生化的人骨髓间充质干细胞系,为其在神经系统疾病治疗中的应用奠定了实验基础。

2-叔丁基-3-苯硫基-1H-吲哚的合成研究

首先邻碘苯胺与3,3-二甲基丁炔通过Sonogashira交叉偶联反应生成邻-(3,3-二甲基-1-丁炔基)苯胺,然后邻-(3,3-二甲基-1-丁炔基)苯胺再与二苯基二硫醚在碘单质的作用下发生亲电环合反应合成2-叔丁基-3-苯硫基-1H-吲哚,重要的是该步反应是在无金属条件下进行的。反应总收率84.7%,产物结构经由NMR和MS确证。

RNAi双沉默Survivin和hTERT基因抑制人结肠癌SW480细胞增殖促进凋亡

目的探讨双向沉默Survivin和h TERT基因对结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响,为结肠癌的基因治疗提供实验依据。方法设计并构建能够稳定转录shRNA并可分别及联合干扰Survivin和h TERT分子表达的质粒,将其转染结肠癌SW480细胞后,分阴性对照组、空白质粒对照组、Survivin RNAi组、h TERT RNAi组和Survivinh TERT RNAi组。转染48h后TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性,RT-PCR法检测Survivin和h TERT mRNA的表达,Western blot检测Survivin和h TERT蛋白的表达,流式细胞仪及cck-8法分别检测细胞凋亡和细胞增殖的变化。结果 Survivin-h TERT RNAi组SW480细胞端粒酶活性明显下降(P<0.01),Survivin-h TERT RNAi组Survivin及h TERT的mRNA水平较正常对照组分别减低82.8%和73.6%(P<0.01),蛋白表达抑制率分别为79.2%和66.7%(P<0.01)。实验各组中Survivin-h TERT RNAi组细胞增殖抑制率和凋亡率最高,分别为43.6%±0.1%和39.2%±2.3%(P<0.01)。结论 Survivin和h TERT双干扰质粒可明显下调Survivin和h TERT蛋白的表达,抑制结肠癌SW480细胞的增殖,促进其凋亡。

丝光沸石分子筛催化甲苯与叔丁醇气相合成对叔丁基甲苯

丝光沸石作为催化剂,采用气相催化甲苯和叔丁醇合成对叔丁基甲苯,考察了反应条件和碱改性丝光沸石对催化活性的影响。采用XRD、NH3-TPD、FT-IR、比表面积测定等方法对催化剂进行了表征。实验结果表明:适宜的反应条件为反应温度180℃,进料体积空速4 mL/(g h),原料甲苯与叔丁醇物质的量比2:1,在此条件下,甲苯转化率达到29%,对叔丁基甲苯选择性达到最大值74%。碱改性后消除了催化剂的强酸中心,而增加了弱酸中心,但孔径变大,比表面积变小。催化活性有所提高,甲苯转化率和对叔丁基甲苯选择性分别提高了4%和7%。