补体因子H相关蛋白1促进巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α调控足细胞增殖和迁移实验研究

目的:探讨补体因子H相关蛋白1(CFHR1)通过巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)调控足细胞增殖和迁移的作用。方法:体外培养人单核巨噬细胞和人肾足细胞。巨噬细胞分为对照组和CFHR1干预组,分别进行牛血清白蛋白或CFHR1重组蛋白干预24 h,ELISA法测定上清液TNF-α水平。足细胞分为空白组、TNF-α干预组、对照上清液干预组、CFHR1上清液干预组、CFHR1上清液+TNF-α中和抗体干预组。CCK8法检测各组细胞增殖。Transwell法检测各组细胞迁移。Wb法检测各组细胞中相关蛋白变化。结果:巨噬细胞的CFHR1干预组上清液中TNF-α含量显著增加(P<0.05)。与空白组比较,TNF-α干预组、CFHR1上清液干预组的细胞增殖比率和迁移数量均显著降低(均P<0.05)。与CFHR1上清液干预组比较,CFHR1上清液+TNF-α中和抗体干预组的细胞增殖比率和迁移数量均显著提高(均P<0.05)。与空白组比较,TNF-α干预组、CFHR1上清液干预组的足细胞裂孔膜蛋白(Nephrin)、足突蛋白(Podocin)、纤维状肌动蛋白(F-Actin)、整合素α3β1蛋白(α3β1)表达均显著降低(均P<0.05)。与CFHR1上清液干预组比较,CFHR1上清液+TNF-α中和抗体干预组的Nephrin、Podocin、F-actin、α3β1蛋白表达均显著增多(均P<0.05)。结论:CFHR1促进巨噬细胞分泌的TNF-α可显著抑制足细胞增殖水平和迁移能力,这可能是高浓度CFHR1促进肾病综合征发展的途径。

血清金属硫蛋白1H、巨噬细胞移动抑制因子对骨肉瘤患儿免疫靶向治疗疗效的评估价值

目的探讨血清金属硫蛋白1H(MT1H)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)对骨肉瘤(OS)患儿免疫靶向治疗疗效的评估价值。方法选取52例OS患儿,均采取α干扰素联合贝伐珠单抗治疗,治疗前、治疗12周后检测OS患儿的血清MT1H、MIF水平。记录OS患儿的治疗效果,将完全缓解和部分缓解患儿纳入有效组,疾病稳定和疾病进展患儿纳入无效组。比较有效组和无效组患儿的临床特征,采用Logistic回归模型分析OS患儿免疫靶向治疗疗效的影响因素。结果治疗12周后,OS患儿血清MT1H、MIF水平均明显低于治疗前,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。52例患儿中,治疗有效35例,治疗无效17例。有效组患儿治疗后碱性磷酸酶(ALP)、MT1H、MIF水平均低于无效组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示,治疗后ALP、MT1H、MIF高水平均是OS患儿免疫靶向治疗疗效的独立危险因素(P﹤0.05)。结论血清MT1H和MIF水平对OS患儿免疫靶向治疗疗效具有重要的评估价值,可为临床治疗方案的制订提供一定依据。

水稻组蛋白H1三突变体的创建和转录组学分析

【目的】组蛋白H1对于染色质高级结构的维持和稳定具有重要作用,研究水稻H1对基因表达的影响,为深入理解水稻H1的生物学调控功能提供依据。【方法】通过半定量RT-PCR与RT-qPCR对水稻4个H1基因进行表达分析,利用CRISPR技术创建水稻H1基因编辑植株,鉴定突变体表型,对突变体进行转录组学分析。【结果】水稻4个H1基因的表达比较广谱,在根中的表达较低;在T_(0)代CRISPR突变体筛选过程中发现H1.1-H1.4发生多种突变;在T_(1)代筛选到一株Osh1.1 Osh1.3 Osh1.4纯合三突变体,该三突变体具有多种发育缺陷,成为转录组分析的材料;进一步在T_(2)代得到三突和四突群体,该群体约25%为白化苗,植株生长迟缓,在响应干旱胁迫方面发生缺陷;对三突变体进行转录组学分析,鉴定到1055个差异表达基因,显著上调的基因约为下调基因的2.5倍,说明H1可能具有抑制基因表达的功能。【结论】在突变体中,光合作用、胁迫响应、氨基酸代谢和RNA代谢等多种途径均发生调控紊乱;其中,核糖体蛋白和光合作用相关基因显著上调,与干旱胁迫相关的脱氢酶基因显著下调。核糖体途径基因过量表达可能造成蛋白质稳态失调,导致植物发育缺陷。

基于生物信息学方法和动物实验方法获取多房棘球蚴病组蛋白H3K4ME1的生物学功能和信号通路信息

目的基于生物信息学方法和动物实验方法获取多房棘球蚴病组蛋白H3K4ME1的生物学功能和信号通路信息。方法1.提取冻存组织细胞核。2.构建cut&tag文库。3.分析生物信息:1)评估多房棘球蚴病组蛋白H3K4ME1的测序数据;2)确定reads在基因组上的分布;3)分析单个样本富集区间信息;4)分析peak转录因子;5)分析与Peak关联基因的GO功能富集、KEGG通路富集情况;6)分析差异关联基因基本情况;7)分析差异关联基因的GO功能富集情况;8)分析差异关联基因的KEGG通路富集情况。结果1.提取冻存组织细胞核:在显微镜下观察到细胞核计数>100000,表示细胞核提取成功。2.测序文库构建后,用qubit软件检查测序文库,结果显示合格。3.生物信息分析结果:1)实验组与参考基因库之间的数据相似程度>98%(测序数据良好),可进行下一步检测;2)多房棘球蚴病组和健康小鼠组的reads在TSS明显起峰;3)通过单个样本的富集,筛选出显著性Peak;4)与peak关联的转录因子主要集中在zf-C2H2、Homeobox和BHLH等;5)与Peak关联基因的GO功能主要富集在细胞蛋白大分子定位、细胞发育调节、解剖结构形态调控等生物学过程,与peak关联基因的KEGG通路主要富集在MAPK、cGMP-PKG、Hippo等信号通路;6)多房棘球蚴病组与健康小鼠组的组蛋白H3K4ME1存在5547个差异关联基因,其中上调基因2556个、下调基因2929个;7)组蛋白H3K4ME1差异关联基因GO功能富集分析的生物过程主要有细胞投射组织的正向调节、GTPase的活性调节等,细胞组分主要有细胞投影膜、突触等,分子功能主要有肌动蛋白结合、细胞黏附分子结合等;8)组蛋白H3K4ME1差异关联基因KEGG通路富集分析主要分布在MAPK、Wnt、Rap1等信号通路上。结论获得了多房棘球蚴病组蛋白H3K4ME1的生物学功能和信号通路信息。

nm23H_1蛋白及DNA倍体状态与食管癌区域淋巴结转移相关性研究

目的 :研究nm2 3H1蛋白、DNA倍体状态与食管癌区域淋巴结转移的相关性及临床意义。方法 :应用流式细胞荧光免疫技术检测食管癌新鲜手术标本食管癌组织 (癌 )、食管癌旁 1cm粘膜 (癌旁 )、食管正常粘膜 (切缘 )及食管癌区域淋巴结 (淋巴结 )组织中nm2 3H1蛋白表达及DNA倍体状态。结果 :nm2 3H1蛋白表达阳性率在食管癌旁、切缘、癌及淋巴结组织中依次降低 ,在有转移组分别为 16 65%、9.4 4 %、4 .99%和 8.30 % ,在无转移组分别为 2 4 .77%、14.4 9%、7.0 9%和 3.81%。在无转移组内 ,切缘与癌及淋巴结组织间差异显著 (P <0 .0 5)。在有转移组内差异无显著性 (P >0 .0 5) ;食管癌组织中异倍体发生率为 89.58% ( 4 3/48) ,异倍体发生与淋巴结转移及nm2 3H1蛋白表达之间无显著相关性。结论 :nm2 3H1蛋白表达与食管癌区域淋巴结转移之间呈负相关 ;DNA倍体状态与食管癌组织nm2 3H1蛋白表达及区域淋巴结转移之间无相关性。nm2

甲状腺乳头癌中P16和nm23-H_1蛋白的表达及其意义

目的 探讨抑癌基因P16及转移制基因nm 2 3 -H1在甲状腺乳头状癌中的表达及其与淋巴结转移的关系。方法 应用免疫组化方法检测 42例甲状腺乳头状癌及 11例良性甲状腺中P16,nm 2 3 -H1蛋白的表达 ,分析其与甲状腺乳状癌的发生及淋巴结转移的关系。结果 P16蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达明显低于良性甲状腺瘤组 ,两者之间其差异有显著性 ,nm2 3 -H1蛋白表达与甲状腺乳头状癌颈部淋巴结转移关系密切。结论 P16蛋白表达缺失与甲状腺乳头状癌发生有关 ,nm 2 3 -H1具有抑制甲状腺乳头状癌淋巴结转移的功能 ,其nm2 3

人组蛋白H1基因的原核表达、纯化及其活性检测

目的:克隆人组蛋白H1全长编码区基因,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化以及活性检测。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人组蛋白H1全长编码区基因,将其克隆到pGEX-KG载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达与纯化产物。结果:从人乳腺文库中扩增获得约650 bp的DNA片段,并成功克隆至pGEX-KG载体上,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出相对分子质量(Mr)约为52 000的目的蛋白,经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白GST-H1,激酶实验证明该蛋白活性良好。结论:成功获得了活性良好的重组蛋白GST-H1,为后续研究细胞周期蛋白调控奠定了实验基础。

小鼠B7H1-Ig融合蛋白诱导免疫抑制的机制研究

为了探讨小鼠B7H1-Ig融合蛋白诱导免疫抑制的机制,应用抗CD3抗体协同B7H1-Ig融合蛋白刺激纯化的CD4+T细胞,检测其增殖效应和培养上清细胞因子水平的变化,并观察B7H1-Ig对不同品系小鼠混合淋巴细胞反应的抑制作用。发现B7H1-Ig有引起T细胞先增殖后抑制的现象,其抑制作用通过IL-10、TGF-β和受体PD-1,并有调节性T细胞的参与。研究为B7H1-Ig进一步应用于临床疾病的免疫调控打下基础。

金鱼H 1组蛋白基因及其N端片段的克隆、表达及抗菌活性

用RT-PCR方法从金鱼体内成功分离得到编码H 1组蛋白的基因,基因登录号AY 184811。该基因与来源于大西洋鲑鱼的抗菌蛋白-H 1组蛋白有极高的同源性(78%)。将全长基因及其N端(2-38氨基酸)序列成功克隆于毕赤酵母分泌表达载体pP IC 9K并表达;表达产物初步检测有抗菌活性。结果表明,金鱼H 1组蛋白为一种新发现的抗菌蛋白,其N端来源肽(AEVAPAA SAPPAKAPKKK SAAKA KKAGPAVGDL IVKA)为抗微生物肽。金鱼H 1组蛋白及其来源肽在金鱼先天免疫防御中发挥作用。

组蛋白H1序列固有无序特性分析

组蛋白H1对于高阶染色质结构的形成和基因表达调控具有重要作用.为了揭示组蛋白H1在染色质结构形成中的生物学机制,本文对组蛋白H1三个结构域C-terminal domain(CTD)、N-terminal domain(NTD)和Globular domain(GD)及各区域连接位点对应序列氨基酸偏好、复杂度等序列特征进行了系统对比研究,并对各区域进行了固有无序蛋白有序区/无序区预测分析.结果表明,组蛋白H1三个结构中,中间的球状结构域(GD)中的氨基酸序列是非常保守的,NTD富含疏水氨基酸,CTD末端富含碱性氨基酸.进一步的研究表明,CTD和NTD两个结构域普遍具有固有无序特性,因此这些区域具有较大的柔性结构,对其在染色质形成中行使的重要生物学功能具有重要意义.

花生致敏蛋白Ara h 1双抗体夹心ELISA法的建立

为建立用于花生致敏蛋白Ara h 1快速、灵敏、特异检测的双抗体夹心ELISA法,以Ara h 1鼠源单抗(mAb)为捕获抗体,以Ara h 1兔源多抗(pAb)为检测抗体,通过棋盘法优化抗体工作浓度建立方法,并对方法的灵敏度、特异性、准确度、稳定性等检测特性进行鉴定。结果表明,双抗体夹心ELISA法的mAb和pAb最佳工作浓度分别为1∶10000稀释和1∶8000稀释;ELISA标准曲线线性范围为4~256 ng/mL,检测限为4.16 ng/mL;样品添加回收试验的平均回收率为85.9%~94.5%,且该方法与其他常见致敏蛋白无交叉反应;并能在4℃条件下避光密封保存90 d内保持检测结果稳定。说明所建立的双抗体夹心ELISA法灵敏特异、准确稳定,能够用于花生致敏蛋白Ara h 1的快速筛查。

菲咯啉铜配合物与组蛋白H1的相互作用

用IAsys光学生物传感器与荧光淬灭法研究了菲咯啉铜配合物与组蛋白H1的相互作用,得出了在25℃和pH 7.4条件下两者的结合常数和结合位点数.结果表明,菲咯啉铜配合物与组蛋白H1具有较强的相互作用,其结合常数数量级可达到105,两者相互作用时只有一个结合位点,菲咯啉铜配合物与组蛋白H1的结合常数是单独的菲咯啉配体的6倍.推测菲咯啉铜配合物在诱导细胞凋亡的过程中在与组蛋白H1结合处切割核小体上的DNA,从而产生凋亡所特有的DNA片段化阶梯现象.

花生致敏蛋白Ara h1与咖啡酸互作对其抗原性的影响

为探寻适宜的花生脱敏方法,该文研究了花生致敏蛋白Ara h1与咖啡酸互作对其抗原性的影响,利用荧光光谱、紫外光谱和间接ELISA法对碱法、酶法、自由基法处理后的咖啡酸蛋白复合物抗原性变化进行了分析,并对碱法互作反应温度、反应时间、pH值、咖啡酸浓度进行优化。结果表明:在温度33.2℃、时间25 h、pH值8.67和咖啡酸浓度1.76 mg/mL时,咖啡酸与花生致敏蛋白Ara h1碱法互作后其抗原性降至69.31%,接枝量为119.16 nmol/mg。碱法处理后,咖啡酸与花生致敏蛋白Ara h1互作能降低致敏蛋白抗原性,研究结果可为花生脱敏处理提供参考。

金属硫蛋白1H在晚期非小细胞肺癌中的表达及预后分析

目的:研究分析晚期非小细胞肺癌中金属硫蛋白1H(MT1H)的表达及其与临床病例的关系,并观察MT1H与病人的生存关系。方法:收集经病理确诊的40例晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者经含顺铂方案化疗前后的外周静脉血,采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测MT1H的表达,并将疗效和病人的生存资料与MT1H的表达进行比较。各种临床特征的分析采用t检验和单因素方差分析,用Kaplan-meier法和Cox回归进行生存分析。结果:化疗前MT1H表达水平明显低于化疗后(P<0.05),且与肿瘤的分化程度、淋巴结转移密切相关(P<0.05)。有效者化疗前后的表达差异与无效者比较差异无统计学意义(P>0.05)。MT1H阴性组和阳性组中位生存期分别为304 d和246 d。Kaplan-meier分析显示MT1H阴性组和阳性组的总体生存率无差别,Cox回归模型显示年龄段有独立预后作用。结论:①晚期非小细胞肺癌中MT1H表达与肿瘤的分化程度及淋巴是否结转移有相关关系,可以作为判断预后的实验室指标及临床确定治疗方案的参考依据;②MT1H阳性表达显示可能存在耐药性问题。

金属硫蛋白1H在晚期NSCLC患者外周血中的表达及其意义

收集经病理确诊的40例晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者经含顺铂方案化疗前后的外周静脉血,采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测金属硫蛋白1H(MT1H)的表达。化疗前MT1H表达水平明显低于化疗后(P<0.05),且与肿瘤的分化程度、淋巴结转移密切相关(P<0.05)。有效者化疗前后的表达差异与无效者比较无明显差异。提示MT1H可作为确定治疗方案、判断预后的实验室指标;MT1H阳性表达可能耐药,但能否作为晚期NSCLC对含铂方案耐药的分子指标,值得进一步研究。

黄瓜质膜型Na^+/H^+逆向转运蛋白基因(SOS1)的克隆与序列分析

采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法从黄瓜Cucumis sativusL.中克隆出质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的cDNA(CsSOS1),该cDNA全长3 638bp,其中开放阅读框为3 435bp,编码1 145个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,CsSOS1氨基酸序列与水稻OsSOS1和拟南芥AtSOS1的氨基酸序列同源性较高,分别为64%和58%,而与液泡型的Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列亲缘关系较远。蛋白质跨膜结构分析表明CsSOS1包含11个完全跨膜片段。激光共聚焦显微镜显示CsSOS1基因的编码区与YFP基因融合后,定位在细胞膜上。酵母功能互补试验结果显示CsSOS1参与Na+与H+的转运,表明该基因转化酵母后可以补充酵母SOS1的缺失。

质谱法分析大鼠精子发生过程中组蛋白H1变异体的多样性

目的为探究连接组蛋白H1在精子发生过程染色体重构中的功能,了解一共有多少种连接组蛋白H1参与各期生精细胞的染色体的构建。方法分离高纯度的SD大鼠的各期生精细胞,提取组蛋白,应用SDS-PAGE分离组蛋白的各组分,组蛋白(H1)经过蛋白酶(Glu-c和Arg-c)酶切,应用质谱进行检测。结果鉴定了组蛋白H1的体细胞亚型(H1.1-H1.5)和睾丸特异的连接组蛋白亚型(H1t)。组蛋白H1t分别表达在精原细胞,精母细胞和圆形精子细胞中。结论大鼠精子发生过程中,其主要连接组蛋白H1的种类是:H1.1-H1.5和H1t。

糖基化终末产物所致大鼠肾皮质损伤与Na^+/H^+交换蛋白1关系的探讨

目的观察Na+/H+交换蛋白1(NHE-1)抑制剂cariporide对糖基化终末产物(AGEs)所致肾皮质损伤的影响,探讨NHE-1在AGEs所致肾损伤中的作用。方法参考文献方法制备肾皮质薄片,用外源性AGEs与肾薄片在DMEM培养液(37℃,95%O2和5%CO2)孵育120 min,以乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、丙二醛(MDA)含量,谷胱甘肽(GSH)活性和NHE-1表达为指标,观察NHE-1抑制剂cariporide、anti-RAGEs对AGEs所致肾皮质损伤的影响。结果AGEs能明显上调肾皮质NHE-1表达,使肾皮质中MDA含量和孵育液中LDH漏出率分别升高2.2倍和2.4倍(P<0.01),GSH活性降低3.5倍(P<0.01);Cariporide(0.1、1μmol.L-1)能显著抑制AGEs引起的这些变化(P<0.01)。anti-RAGE也能明显阻断AGEs对肾皮质的损伤作用(P<0.01)。结论AGEs引起的肾皮质损伤主要是通过与受体RAGE结合所导致,NHE-1激活可能参与了AGE-RAGE反应引起肾损伤。

hil-1基因通过饮食限制通路调节秀丽隐杆线虫寿命

目的揭示H1连接子组蛋白基因(H1 linker histone gene,hil-1)的生理学功能,以及其调控线虫寿命的分子机制。方法以秀丽隐杆线虫为模式生物,采用RNA干扰菌喂食、hil-1(gk229)突变体回交纯化以及过表达质粒显微注射技术来敲降、敲除以及过表达hil-1基因,然后观察线虫存活寿命及产卵情况,通过热耐受实验、百草枯应激实验和重金属Cr6+应激实验评价hil-1(gk229)突变体的抗逆性,利用实时荧光定量PCR实验以及构建双突变体线虫进一步确定hil-1调控寿命所关联的信号通路和作用靶点。结果与野生型N2线虫相比,RNA干扰后的线虫寿命以及hil-1(gk229)突变体线虫寿命明显缩短(P<0.001),而hil-1全身性过表达后线虫寿命延长(P<0.05)。与野生型N2线虫相比,hil-1(gk229)突变体线虫对热压力和氧化压力的耐受性明显降低(P<0.001,P<0.05),而对重金属的耐受能力无差异(P>0.05)。并且,相比于野生型N2线虫,hil-1(gk229)突变体线虫的发育周期缩短(P<0.001),产卵提前(P<0.001),但产卵总量没有显著变化(P>0.05)。给eat-2(ad465)突变体线虫喂食hil-1 RNA干扰菌后,hil-1表达下调不影响eat-2(ad465)突变体线虫的寿命(P>0.05)。相较于野生型N2线虫,hil-1(gk229)突变体线虫中daf-16表达水平明显下调(P<0.001),其下游基因mtl-1和ctl-1表达也下调(P<0.05,P<0.001)。与daf-2(e1370)突变体相比,daf-2(e1370),hil-1(gk229)双突变体线虫的寿命无明显变化(P>0.05),而与daf-16(mu 86)突变体相比,daf-16(mu86),hil-1(gk229)双突变线虫的寿命明显缩短(P<0.001)。与对照组相比,在表皮和肠道中RNA干扰hil-1基因表达后线虫寿命明显缩短(P<0.001)。结论hil-1基因缺失明显缩短线虫寿命,同时使线虫对热压力和氧化压力的耐受性降低。hil-1基因可能通过饮食限制信号通路调控秀丽隐杆线虫的寿命,且该作用主要在表皮和肠道。