hBcl-2基因转染对大鼠肝移植缺血再灌注损伤的保护作用

目的研究hBcl-2基因转染对大鼠肝脏抗缺血再灌注损伤的效应,并探讨其减轻移植肝缺血再灌注损伤的可行性。方法(1)同源重组法构建复制缺陷型重组腺病毒Adv-EGFP、Adv-Bcl-2,转染293细胞并包装成腺病毒颗粒后大量扩增和纯化。同法构建空载体病毒质粒;(2)雄性SD大鼠,随机分为Adv-Bcl-2转染组、Adv-EGFP转染组、缺血再灌注组、假手术对照组,以两袖套法建立同种异体肝移植模型。转染组经门静脉灌注转染重组腺病毒Adv-Bcl-2或Adv-EGFP;缺血再灌注组、假手术对照组不予任何处理。实时定量PCR和Western blotting检测各组肝组织bcl-2mRNA和蛋白表达变化;门静脉血流恢复后第0、60及180min三个时间点测定受体血清AST、LDH、MDA含量。组织切片检测肝细胞形态改变。结果 Adv-Bcl-2转染组bcl-2mRNA和蛋白表达水平较Adv-EGFP转染组和对照组明显增高(P<0.01);Adv-Bcl-2转染组中血清AST、LDH含量明显低于Adv-EGFP转染组和缺血再灌注组。Adv-Bcl-2组血清MDA水平明显低于缺血再灌注组和Adv-EGFP组(P<0.01)。与假手术组比较,Adv-Bcl-2处理组HE染色见少量肝细胞水肿和空泡变性,未见片状或点状坏死等。缺血再灌注组和Adv-EGFP组HE染色镜下观察可见小叶结构破坏、肝细胞弥漫不同程度水样变性、体积明显增大、细胞间边界模糊,还可见大量细胞出现脂肪变性及少量碎片状坏死。结论 Adv-Bcl-2转染能通过诱导bcl-2基因表达减轻移植肝缺血再灌注损伤。

hBcl-2和hVEGF_(165)双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为后续基因转染和动物实验提供实验基础。方法通过RT-PCR从A549细胞中分别获得hBcl-2和hVEGF165基因片段,并克隆到pMD-19T载体。将目的基因hBcl-2、IRES元件和hVEGF165依次定向克隆到腺病毒穿梭载体质粒pAd-Track-CMV上。线性化重组穿梭质粒后通过电穿孔转化含有腺病毒骨架质粒pAd-easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。脂质体转染线性化的重组腺病毒载体质粒于HEK293细胞以包装制备重组腺病毒。重组腺病毒经PCR鉴定之后进一步扩增、纯化。通过荧光计数确定病毒感染滴度。结果克隆的hBcl-2和hVEGF165基因测序正确,酶切重组穿梭载体质粒和腺病毒载体质粒得到特异酶切产物,重组腺病毒载体质粒转染HEK293细胞3 d后观察到GFP的表达,重组腺病毒的PCR得到hBcl-2和hVEGF165基因的PCR产物,滴度测定为5×109pfu/mL。结论成功构建制备了高滴度的hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为联合基因治疗心肌梗死的研究提供实验基础。

hBcl-2和hVEGF_(165)双基因重组腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的将hBcl-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测目的基因的表达及表达产物的生物学效应。方法贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞;重组腺病毒转染BMSCs,用PCR法验证目的基因mRNA在间充质干细胞中的表达;用ELISA及Western Blot检测双基因在转染后细胞的蛋白表达量;用MTT法及Annexin V-PE/7-AAD法分别观察对转染后BMSCs增殖及凋亡的影响。结果大鼠BMSCs分离纯化成功。在mRNA水平,转染后的BMSCs可表达这两个外源基因;转染后细胞培养上清液hVEGF165峰浓度达到(924.3±56.5)pg/mL,多个时间点与对照组相比,浓度差异有统计学意义(P<0.05);Western Blot也检测到转染后细胞Bcl-2蛋白表达量明显比对照组增加(P<0.05)。MTT比色法观察到,转染细胞分泌的hVEGF165上清液可促进BMSCs的增殖(P<0.05);用Annexin V-PE/7-AAD检测转染后间充质干细胞的凋亡率下降,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论转染重组腺病毒载体的BMSCs能够表达hBcl-2及hVEGF165,并且表达产物具有生物学效应。

hBcl-2基因修饰的骨髓基质细胞对体外培养PC12细胞的保护作用

目的观察hBcl-2转染的骨髓基质细胞(MSCs)对体外培养PC12细胞的保护作用,为下一步hBcl-2修饰的MSCs脑内移植治疗奠定基础。方法采用密度梯度离心结合贴壁法分离、培养大鼠MSCs,对培养第3代的MSCs进行鉴定;hBcl-2用脂质体转染MSCs建立MSCs-hBcl-2基因工程细胞;用H2O2建立PC12细胞氧化应激损伤模型;MTT法检测MSCs-hBcl-2基因工程细胞上清对体外培养的PC12细胞活性的影响。结果成功培养出MSCs细胞,免疫组化结果显示培养的细胞CD44、CD71表达阳性,而CD45表达阴性;建立了有稳定高效hBcl-2表达的MSCs-hBcl-2基因工程细胞,并观察到MSCs-hBcl-2基因工程细胞较MSCs更能减轻PC12细胞的氧化损伤(P<0.05)。结论hBcl-2基因修饰的MSCs对PC12细胞的生长、生存有着重要的保护作用。

人Bcl-2蛋白的基因克隆、表达及初步活性分析

目的 :以特定形式对高度疏水性的人Bcl 2 (hBcl 2 )蛋白进行可溶性表达 ,获得非疏水性hBcl 2蛋白并具备生物学结合活性 ,为进一步研究hBcl 2三维结构并在此基础上研发特异性小分子药物提供充足的蛋白样品。方法 :用PCR方法对hBcl 2基因进行克隆重组 ,插入原核表达载体pET2 8a(+)中。用WesternBlot和MALDI TOF生物质谱鉴定 ,采用荧光极化方法进行活性测定。结果 :重组hBcl 2在E .Coli中实现了高效、可溶性的融合表达 ,重组蛋白经纯化至电泳纯 ,具备了与Bcl 2家族Bak蛋白BH3功能域特异结合的能力 ,表明原核表达的重组hBcl 2具有较好的结合活性。结论 :成功地对重组hBcl 2蛋白进行了可溶性表达和活性测定。