肝癌相关蛋白HCAP1的表达、抗体制备及其亚细胞定位

目的 :肝癌相关基因HCAP1蛋白产物的表达、抗体的制备及其亚细胞定位。方法 :原核表达HCAP1蛋白 ;纯化的HCAP1蛋白免疫新西兰大白兔 ,制备多抗血清 ;Westernblot分析其在肝癌细胞株的表达 ;通过荧光免疫细胞化学进行亚细胞定位。结果 :获得了较纯的HCAP1表达蛋白和高效价的、高特异性的抗HCAP1的多抗血清 ,并且发现HCAP1大部分位于胞浆 ,少量分布于核仁。结论 :表达的HCAP1蛋白和抗HCAP1的多抗血清可用于HCAP1基因功能的研究 ;HCAP1功能场所可能位于核仁。

肝癌相关基因HCAP1的定位克隆和初步功能研究

目的 克隆和筛选位于染色体 17p13.3缺失区内的肝癌相关基因。方法 采用定位克隆的策略 ,通过PAC筛库和RACE(rapidamplificationofcDNAends)方法克隆新基因 ;通过多组织膜片Northern杂交分析其组织表达谱 ,Southern杂交分析其在肝癌组织DNA水平上的变化 ,然后通过克隆集落形成实验与MTS法测定细胞生长速度 ,初步筛选其作为肿瘤相关基因的可能性。结果 克隆到一个基因HCAP1(HCC associatedprotein 1,先前又称HC5 6 ) ,GenBank登录号为AF177341。多组织膜片杂交显示该基因在多种组织中表达 ,其中胎盘、肝脏和肌肉中表达较高。Southern杂交结果显示HCAP1基因在肝癌组织中存在缺失 ,比例为 2 5 .3% ;克隆集落形成实验与生长抑制率测定实验初步表明该基因能抑制肝癌细胞株Hep3B细胞的生长 ,抑制率为 31.8%。结论 HCAP1可能与肝癌的发生发展相关 ,是一个新的肝癌相关基因的侯选者。

HCAP1两种基因型对肝癌细胞系Hep3B基因表达的影响

背景与目的:HCAP1(HCC-associatedprotein1)基因是我们室克隆的一个新基因,HCAP1基因有N和M两种基因型,本研究旨在探讨HCAP1N和HCAP1M基因型对肝癌细胞基因表达的影响。方法:用脂质体转染试剂,将HCAP1M与HCAP1N分别转染Hep3B-Tet-on肝细胞性肝癌细胞株;为了获得高诱导表达HCAP1N或HCAP1M的细胞株,通过Westernblot方法筛选被转染的细胞。然后,通过人cDNAarray膜片杂交技术分析HCAP1N或HCAP1M诱导表达前后的细胞基因表达谱。杂交结果用复日Smartview2001图像分析软件进行分析比较。结果:建立了HCAP1N和HCAP1M过表达前后的差异基因表达谱。结果表明HCAP1M过表达引起参与细胞增殖的基因表达上调(如c-erbB2受体和转录因子DP2),以及起凋亡作用基因(caspase9)及DNA切割修复蛋白基因(ERCC5)的表达下调;而HCAP1N过表达引起抑制细胞生长基因(如snoN和WAF1)和DNA切割修复蛋白基因(ERCC5)的表达上调,以及抗凋亡基因(HSPs)的表达下调。结论:HCAP1M基因过表达可能促进细胞过度增殖,HCAP1N过表达可能抑制细胞生长。

Jurkat细胞转染外源HCAP1基因后的增殖抑制

HCAP1基因系人类染色体 17p13 .3区带克隆的新肝癌相关基因。已发现人类多种肿瘤存在此区带的杂合性缺失。本研究应用脂质体介导法将HCAP1基因转染T淋巴瘤Jurkat细胞系 ,经G418筛选 ,获得稳定表达外源HCAP1基因的细胞。用台盼蓝拒染试验计数活细胞 ,绘制生长曲线 ,进行软琼脂集落形成试验。结果显示 :与转染空载体质粒 pBK/CMV的细胞比较 ,转染外源HCAP1基因的Jurkat细胞增殖速率明显减慢 ,细胞倍增时间延长 ,在软琼脂上的集落形成能力下降 (P <0 .0 1)。结论 :外源HCAP1基因产物对Jurkat细胞的增殖有明显的抑制作用。

人源抗菌肽LL-37/hCAP-18真核表达载体的构建及其在人乳腺癌细胞MCF-7中的表达

目的构建人源抗菌肽LL-37/hCAP-18的真核表达载体,并在人乳腺癌细胞MCF-7中进行表达。方法以重组质粒pcDNA4.0-LL-37为模板,采用PCR法扩增LL-37/hCAP-18基因,连入pEGFP-c1质粒,构建真核表达载体pEGFP-c1-LL-37,瞬时转染人乳腺癌细胞MCF-7,采用激光共聚焦显微镜观察重组质粒的转染效率,RT-PCR法检测目的基因的表达。结果所构建的抗菌肽LL-37/hCAP-18真核表达载体经双酶切和测序证明构建正确,在瞬时转染MCF-7细胞48h后,目的基因转染效率较高,约为40%,RT-PCR结果显示,重组质粒转染的细胞可扩增出339bp的目的基因条带。结论已成功构建了人源抗菌肽LL-37/hCAP-18的真核表达载体,并在人乳腺癌细胞中获得表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定了基础。

HCAP1蛋白在急性白血病患者外周血原始细胞中的表达

目的:了解HCAP1蛋白在急性白血病患者外周血原始细胞中的表达。方法:分离18个正常个体外周血白细胞和20例急性白血病患者原代白血病细胞,用免疫细胞化学染色和Western印迹分析HCAP1蛋白表达并进行比较。结果:受检的正常入外周血自细胞和白血病患者原始细胞均表达HCAP1蛋白;在正常人外周血成熟白细胞,HCAP1主要分布于细胞核,而急性白血病患者的原始细胞在细胞核和细胞质均有分布;急性白血病患者原始细胞HCAP1蛋白的相对表达值(HCAP1／actin的灰度比值)为(0.37±0.23),正常入外周血白细胞的HCAP1蛋白相对表达值为(0.31±0.19,P>0.05)。结论:正常人外周血白细胞和白血病患者的原代白血病细胞均表达HCAP1蛋白,两者之间表达水平并无显著差异,但其在细胞内的分布有所不同。

HCAP1基因对Raji细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2的作用

目的 :研究外源HCAP1基因产物对Burkitt淋巴瘤细胞系Raji细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bax/Bcl- 2的作用。方法 :用脂质体介导的基因转移方法 ,把外源HCAP1基因转染到Raji细胞中 ,用流式细胞术和Hochest 332 58荧光染色检测细胞凋亡 ;用Westernblot检测外源HCAP1基因对凋亡相关蛋白Bax和Bcl- 2蛋白表达的调节。结果 :外源HCAP1基因导入Raji细胞 2 4、4 8和 96h后 ,细胞凋亡率增加。Westernblot显示Bax/Bcl- 2蛋白表达比值明显增高。结论 :转染外源性HCAP1基因可诱导Raji细胞凋亡 ,使Bax/Bcl- 2蛋白表达比例上调可能是HCAP1诱导凋亡的机制之一。

真核表达hCAP-18／LL-37成熟肽对树突状细胞表面分子表达的影响

目的:研究真核表达的人源阳离子抗菌肽-18(hCAP-18)成熟肽LL-37对树突状细胞(DCs)表面分子表达的影响。方法:通过基因克隆方法构建hCAP-18成熟肽LL-37真核表达载体pcDNA4/Myc-His-LL-37,转染人胚肾HEK293细胞株,转染48 h后收获培养上清,与体外以rh-GM-CSF、rh-IL-4联合培养定向诱导分化的不成熟DCs共培养48 h,收获DCs;流式细胞仪检测DCs表面分子CD40及HLA-DR的表达。结果:成功构建成熟肽真核表达载体pcDNA4/Myc-His-LL-37,并实现在其真核细胞HEK293中的表达;流式细胞仪结果显示,pcDNA4/Myc-His-LL-37基因转染HEK293细胞培养上清刺激组DCs中CD40及HLA-DR的表达阳性率与对照组比较均明显升高(P<0.05)。结论:构建了真核表达的hCAP-18成熟肽LL-37,其可上调DCs表面分子CD40及HLA-DR的表达,促进DCs功能的成熟。

hCAP-18/LL-37全长肽真核表达产物对树突状细胞分化成熟的影响

目的研究人源阳离子抗菌肽(hCAP)-18/LL-37全长肽真核表达产物对树突状细胞分化成熟的影响。方法将已构建的hCAP-18/LL-37全长肽真核表达载体pcDNA4/Myc-His-hCAP-18转染Hela细胞株,在转染后48 h收获培养上清;人外周血单个核细胞分离,体外定向诱导分化成树突状细胞(DC);将转染后收获的培养上清与体外培养的DC共同孵育,48 h收获DC,经流式细胞仪检测DC表面分子CD83、CD86、CD40及HLA-DR的表达。结果FCM结果显示:pcDNA4/Myc-His-hCAP-18转染Hela细胞培养上清与pcDNA4/Myc-His空载体转染细胞培养上清相比较,均可上调DC表面分子CD86、CD40及HLA-DR的表达。结论构建的hCAP-18/LL-37全长肽真核表达载体pcDNA4/Myc-His-hCAP-18转染Hela细胞株培养上清液均可上调DC表面分子CD86、CD40及HLA-DR的表达,促进DC的分化成熟。

hCAP基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的:构建hCAP真核表达载体并检测融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:提取工具细胞CV-1的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hCAP基因的cDNA全长,并将其克隆至pEGFP-C1表达载体中。进一步将构建的重组载体进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞COS-7中,提取细胞蛋白进行Western blot。最后利用激光共聚焦显微镜观察pEGFP-hCAP在NIH3T3成纤维细胞内的定位。结果:hCAP基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为3 879 bp,测序证实成功。Western blot检测GFP-hCAP融合蛋白表达,相对分子质量(Mr)约为169 000。pEG-FP-hCAP在NIH3T3细胞中主要定位于细胞周边。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-hCAP,融合蛋白在NIH3T3细胞中主要定位于细胞周边。

转染外源HCAP1基因对Raji细胞化疗敏感性的作用

目的 探讨外源HCAP1基因产物对B淋巴瘤 /白血病细胞系Raji细胞化疗敏感性的作用。 方法 用脂质体介导法 ,把HCAP1基因转染Raji细胞 ,经G4 18筛选后 ,分别与化疗药物DNR(daunoru bicin ,柔红霉素 )、VP16 (etoposide ,足叶乙甙 )和VCR(vincristine,长春新碱 )联合培养 2 4小时 ,用苔盼兰拒染试验计数活细胞。结果 转染HCAP1的Raji细胞 ,在不同浓度的DNR(0 .0 1～ 10 .0 μg/ml)和VP16 (5～ 80 μg/ml)作用下 ,与转染空载体和未转染对照细胞比较 ,细胞活力的抑制作用明显增强 (P <0 .0 5 )、IC50 (半数抑制浓度 )值明显降低 ;但与不同浓度的VCR(12 .5～ 10 0 μg/ml)作用 ,细胞活力的抑制和IC50 值与对照细胞相似。结论 HCAP1过表达可明显增加Raji细胞对DNR、VP16作用的敏感性 。

hCAP-18/LL-37基因转染对Lewis肺癌细胞增殖及凋亡的影响

目的:观察人源抗菌肽hCAP-18/LL-37基因转染对Lewis肺癌细胞增殖的抑制作用,探讨其抗肿瘤的可能机制。方法:将含hCAP-18/LL-37的真核表达质粒瞬时转染Lewis肺癌细胞,同时设正常对照组、转染空载体组和转染重组基因组,MTT比色检测Lewis肺癌细胞转染后48和72h的增殖活性,流式细胞术和荧光染色检测细胞凋亡。免疫细胞化学染色检测Bax、Bcl-2蛋白表达。结果:转染重组基因组Lewis细胞增殖受到明显抑制,与转染空载体组比较,转染后48和72h的抑制率分别为3.51%和17.65%;流式细胞术检测转染重组基因组凋亡率为7.4%,正常对照组凋亡率为4.4%,转染空载体组凋亡率为5.2%;免疫细胞化学染色,转染重组基因组Lewis细胞Bax蛋白表达增加,与对照组比较差异有显著性(P<0.05);Bcl-2蛋白表达减少,但与对照组比较差异无显著性(P<0.05)。结论:hCAP-18/LL-37基因瞬时转染Lewis肺癌细胞,可抑制肿瘤细胞生长、调控凋亡相关基因Bax、Bcl-2表达,诱导肿瘤细胞凋亡。

转染外源HCAP1基因对B淋巴瘤细胞株Raji细胞增殖的作用

目的:HCAP1基因定位于人类染色体17p13．3,此区域在多种肿瘤组织呈杂合性缺失,本研究旨在探 讨HCAP1外源基因产物对B淋巴瘤细胞系Raji细胞增殖的作用。方法:应用脂质体介导法,将HCAP1基因转染Raji 细胞,经G418筛选、获得稳定表达外源HCAP1基因的细胞,用台盼蓝活细胞计数、绘制生长曲线、软琼脂集落培养及 BrdU(5溴-2’脱氧尿嘧啶)标记法,观察HCAP1基因产物对Raji细胞增殖的作用。结果:与转染空载体的对照细胞 比较,稳定表达外源HCAP1基因的细胞生长速度明显减慢,倍增时间明显延长,细胞集落形成数明显减少,BrdU掺 人细胞比例降低。结论:外源HCAP1基因产物的过表达对Raji细胞的增殖有抑制作用。

LL-37/hCAP-18基因克隆及其真核表达载体的构建

LL-37 hCAP-18是一种重要的多功能免疫分子.为探讨hCAP-18在基因治疗中的可行性,应用RT-PCR技术从人白血病细胞系J6-1细胞总RNA中成功扩增出560bp的hCAP-18基因编码区cDNA序列,构建了hCAP-18重组表达质粒phCAP-18.采用脂质体法将质粒phCAP-18瞬时转染COS-7细胞,Westernblot证实,hCAP-18能在COS-7细胞中表达.

hCAP-18/LL-37基因转染对人肺癌细胞凋亡的影响

目的探讨基因转染人源抗菌肽hCAP-18/LL-37对人肺癌细胞A549凋亡的影响。方法将含人hCAP-18/LL-37的真核表达质粒瞬时转染人肺癌细胞A549细胞,48 h后细胞免疫组化染色检测A549细胞中Caspase-3蛋白表达。结果重组基因瞬时转染A549细胞48 h后,免疫细胞化学染色与正常对照组细胞及转染空载体组细胞比较,转染重组基因组细胞Caspase-3蛋白表达增加。结论

hCAP-18/LL-37基因转染对RAW264.7细胞活化功能的影响

目的探讨抗菌肽hCAP-18/LL-37基因转染对巨噬细胞RAW264.7活化功能的影响。方法将重组质粒pcD-NA4/Myc-His-hCAP-18/LL-37瞬时转染RAW264.7细胞,MTT法检测细胞的增殖活性;中性红吞噬试验检测细胞的吞噬能力;RT-PCR法分析细胞活化相关分子CD80、CD86、TLR4及细胞因子IL-1β、TNF-αmRNA的转录。结果 hCAP-18/LL-37基因转染可促进经脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)处理的RAW264.7细胞的增殖活性与吞噬能力(P<0.05);可上调RAW264.7细胞CD80、CD86、TLR4、IL-1β、TNF-α基因mRNA的转录水平。结论 hCAP-18/LL-37基因转染可通过促进RAW264.7细胞增殖活性、吞噬能力及活化相关分子表达,调控巨噬细胞的活化功能。

抗菌肽hCAP 18／LL-37在卵巢癌微环境中的作用及表达调控机制

目的：探讨抗菌肽hCAP18／LL-37在卵巢癌微环境中的作用及表达调控机制。方法采用侵袭实验检测巨噬细胞对卵巢癌细胞SKOV3侵袭能力的影响。采用实时荧光定量PCR（ qRT-PCR）和Western blot检测hCAP18／LL-37和versican V1蛋白的表达。采用干扰质粒抑制 SKOV3细胞中versican V1的表达，分析巨噬细胞hCAP18／LL-37的表达及SKOV3细胞的侵袭能力。结果共培养组（SKOV3细胞与巨噬细胞共培养）的侵袭穿膜数为（112．8±17．1）个，高于SKOV3培养组[SKOV3细胞单独培养，（8．2±1．9）个]，差异有统计学意义（P＜0．05）。 hCAP18／LL-37中和抗体共培养组（SKOV3细胞、巨噬细胞和hCAP18／LL-37中和抗体共培养）的侵袭穿膜细胞数为（22．2±5．6）个，少于对照IgG共培养组[SKOV3细胞、巨噬细胞和对照IgG共培养，（100．6±25．2）个]，差异有统计学意义（P＜0．05）。与SKOV3细胞共培养后，巨噬细胞中 hCAP18／LL-37蛋白和 mRNA水平均升高，而在SKOV3细胞中无变化。与巨噬细胞共培养后，卵巢癌细胞中versican V1蛋白的表达和分泌均升高。干扰卵巢癌SKOV3细胞中versican V1的表达（ SKOV3ver－／－细胞）后，巨噬细胞中hCAP18／LL-37蛋白和mRNA水平均低于对照细胞株（ SKOV3ver＋／＋细胞）；与巨噬细胞共培养后，SKOV3ver－／－细胞的穿膜细胞数[（24．8±4．6）个]低于SKOV3ver＋／＋细胞[（104．6±16．0）个]，差异有统计学意义（P＜0．05）。结论卵巢癌微环境中，巨噬细胞表达分泌的抗菌肽hCAP18／LL-37促进卵巢癌细胞的侵袭，其表达受到肿瘤细胞分泌的versicanV1蛋白调控。

持续血液透析患者肺部感染的临床观察

目的了解持续血液透析患者一般状况、肺部感染及抗菌治疗现状等，为该类人群肺部感染的防治提供理论依据。方法采用自行设定的病例报告表，对2009-01-2010-12北京军区总医院血液净化中心124例持续透析患者回顾调查，并分析其临床特点。结果北京军区总医院持续血液透析患者平均年龄（57．06±16．80）岁，男女比例为57．26％和42．74％。原发疾病以慢性肾小球肾炎最高。持续血液透析患者肺部感染发生率为41．94％，以55岁以上年龄者最为高发。肺部感染暴露组和未暴露组年龄构成差异有统计学意义（P=0．043）。肺部感染和心血管疾病呈正相关（rs=0．188，P=0．036，Ot=0．05）。初始治疗最常选择的抗菌方案为单药治疗，最常选择的抗生素类别为呼吸喹诺酮类，联合治疗中最常选择的抗菌方案为B内酰胺类＋大环内酯类，临床有效率为92．3l％。结论持续血液透析患者肺部感染发生率约为41．94％，以55岁以上年龄者高发，男女发病比例约为1．34：1，原发疾病以慢性肾小球肾炎最高，合并疾病以心血管事件最多。该类患者肺部感染的治疗与其他医疗保健性肺炎（HCAP）人群不同，不可完全遵循HCAP指南。应先按照社区获得性肺炎（CAP）模式管理，同时进行个体化评估，注意有无医院获得性肺炎（HAP）发生的危险因素和特殊病原菌，进而优化抗菌治疗方案。

碱性抗菌蛋白的研究进展

抗菌蛋白和抗菌肽在非特异性免疫中起到越来越重要的作用 ,是解决多药性抗药菌和细菌毒素引起的难治性感染症的有希望的方法 ,本文就hCAP18抗菌蛋白的结构、功能。

健康护理相关性肺炎新进展

健康护理相关性肺炎（HCAP）作为肺炎的一种独立类型，其多重耐药病原体感染风险、初始抗菌药物治疗及临床预后有别于社区获得性肺炎（CAP）及医院获得性肺炎（HAP）。本文综述近几年HCAP研究新进展及目前对其病原学和临床预后的争议，以加深临床医师对HCAP的认识。