鲫TLR9基因克隆及生殖因素对其在肠道表达的影响

为揭示Toll样受体家族基因TLR9在鲫(Carassius auratus L.,缩写为Ca)免疫过程中的作用,本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆获得了鲫TLR9(CaTLR9)基因cDNA,并就注射外源性人绒毛膜促性激素(hCG)和不同性腺周期对该基因在鲫肠道表达的影响进行了分析。结果表明,CaTLR9 cDNA全长3 509 bp,包含3 195 bp的开放阅读框(ORF)、72 bp的5′非编码区和242 bp的3′非编码区。ORF编码1 064个氨基酸组成的蛋白质。该蛋白包含19个氨基酸组成的信号肽,15个富含亮氨酸的重复结构域(LRR),1个跨膜区和1个TIR结构域。系统进化分析表明,CaTLR9与其他鲤科鱼类同源性较高,与鲤(Cyprinus carpio)相似度为92%,其次是草鱼(Ctenopharyngodon idella)和斑马鱼(Danio rerio),分别为83%和79%。实时荧光定量PCR结果表明,CaTLR9在鲫脾中表达量最高,其次为肾和鳃,其他组织的表达量均较低。鲫肠道TLR9在非繁殖期的表达水平明显低于繁殖期,注射适当剂量的外源hCG可显著上调鲫肠道TLR9的表达。本研究对揭示鲫非特异性免疫能力调节机制,提高鲫健康养殖水平具有一定参考价值。

黄颡鱼20β-羟基类固醇脱氢酶Ⅰ和Ⅱ基因特征分析和表达模式研究

为探讨20β-羟基类固醇脱氢酶Ⅰ和Ⅱ(20β-HSDⅠ/Ⅱ)在黄颡鱼中的基因特征和表达模式,研究从黄颡鱼中克隆了这2个基因的全长c DNA。对鱼类2个20β-HSD的系统进化分析和共线性分析结果发现,20β-hsd基因的复制可能不是TSGD的结果。序列对比结果表明,鱼类2个20β-HSD可能具有相似的空间结构,结合相似的辅酶和底物,但催化产物可能有差异。黄颡鱼2个20β-hsd基因均表达于多个组织,其中20β-hsdⅠ主要表达于精巢、卵巢、头肾和肾脏中,而20β-hsdⅡ则高表达于精巢、卵巢、心脏、头肾、肾脏、肠、垂体和肝脏。季节表达模式的研究发现,在繁殖季节(5月)的黄颡鱼精巢中,20β-hsdⅠ的表达相对较低,而20β-hsdⅡ高表达。对黄颡鱼雄性成鱼注射人绒毛膜促性腺激素(h CG)(1000 IU/kg体重)后,20β-hsdⅠ的表达先显著升高,随后迅速显著下调;而20β-hsdⅡ的表达则持续显著上升。上述结果表明,黄颡鱼20β-hsdⅠ和20β-hsdⅡ在h CG处理下表达模式存在较大差异。

人绒毛膜促性腺激素β亚基cDNA的克隆初步报告

用新鲜的人绒毛膜组织，抽提组织总ＲＮＡ并通过逆转录反应合成ｃＤＮＡ第一链。利用人工合成的一对寡核苷酸引物，采用ＰＣＲ技术特异性地扩增ｈＣＧ－β－ｃＤＮＡ。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增片段大小为５００ｂｐ，同预计的片段长度相符。将此片段利用Ｔ－Ａ载体克隆至ＰＣＲⅡ质粒上并进行全序列分析，结果显示克隆片段包含ｈＣＧ－βｃＤＮＡ５’端和３’端非编码区及完整的编码区。