hEPO cDNA重组逆转录病毒的构建

通过ＤＮＡ重组技术，将不含非编码区的ｈＥＰＯｃＤＮＡ片段重组到逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ，ｐＬＮＣＸ中重组质粒转染ＰＡ３１７细胞后，经Ｇ４１８筛选，抗性克隆细胞培养上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，使之在筛选培养基中形成典型的Ｇ４１８抗性克隆，该克隆细胞染色体中成功地整合了ＥＰＯｃＤＮＡ，并且表达出有生物学活性的红细胞生成素（ＥＰＯ）产物。

重组逆转录病毒介导的neo^R基因在公鼠生殖系细胞的转移

将感染滴度为 10 6cfu/ m L、携带新霉素磷酸转移酶 (neo R)基因的重组逆转录病毒与台盼蓝、polybrene按一定比例配制成注射液 ,单侧睾丸注入 14～ 16日龄公鼠曲细精管以体内感染精原干细胞 ,进行重组逆转录病毒 -精原干细胞介导的基因转移研究。注射后 45 d,采集公鼠精液 ,进行精液品质与 PCR检测。结果表明 ,在优化的注射条件下 ,曲细精管内注射重组逆转录病毒后 ,不会干扰小鼠精子的正常发育能力 ,并能够将外源基因整合到精子基因组 ,从而首次通过重组逆转录病毒成功地实现了 neo

重组逆转录病毒介导的肿瘤坏死因子基因转移与哺乳动物细胞表达

以构建的重组肿瘤坏死因子逆转录病毒载体ｐＺＩＰＴＮＦＤＮＡ转染Ｃｏｓ７细胞，获得了ＴＮＦα暂时性表达。采用ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀法，将ｐＺＩＰＴＮＦＤＮＡ导入了单向性逆转录病毒包装细胞ψ２，在Ｇ４１８选择下，克隆出了ψ／ｐＺＩＰＴＮＦ细胞系。该细胞可产生重组ＴＮＦ逆转录病毒。本研究利用ψ／ｐＺＩＰＴＮＦ细胞分泌的重组逆转录病毒连续传代感染ψ２或ＰＡ３１７细胞以及病毒交替感染ψ２和ＰＡ３１７细胞，制备了高滴度单向和双向性重组ＴＮＦ逆转录病毒，其滴度可高达１．４×１０６，并发现获得的病毒滴度在传代感染的第３代达到高峰，随之趋于平衡。利用重组ＴＮＦ逆转录病毒感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，建立了３Ｔ３／ｐＺＩＰＴＮＦ细胞，该细胞的４８ｈ培养上清中可产生３２Ｕ／ｍＬ的ＴＮＦα。利用重组ＴＮＦ逆转录病毒直接感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞后的４８ｈ培养上清中，ＴＮＦα活性也可达到８Ｕ／ｍＬ。实验还观察到３Ｔ３／ｐｚＩＰＴＮＦ细胞有自身生长抑制现象。本研究结果成功地实现了重组逆转录病毒介导的ＴＮＦα基因在哺乳动物细胞中的转移与表达，为进一步实施肿瘤基因治疗奠定了基础。

重组人白细胞介素-6(IL-6)受体基因导入大鼠髓性白血病细胞及基因表达

可移植性大鼠急性粒系白血病(Brown Norway rat acute myelocytic leukemia,BNML)是研究人急性粒系白血病的颇为完备的实验模型。由于重组人IL-6(rhIL-6)可作用于大鼠,然而大鼠BNML细胞系LT12缺乏rhIL-6受体(rhIL-6R)表达。为了在BNML模型探讨rhIL-6在体外以及体内对白血病细胞增殖和分化的影响,本文应用改良的磷酸钙共沉淀法将携带rhIL-6R cDNA的逆转录病毒表达质粒XM6/IL-6RNeo导入LT12细胞,经过G418筛选获得G418抗性克隆,建立了表达rhIL-6R的LT12亚细胞系(称之为R cell lines)。我们分别应用三种不同的方法(rhIL-6R的单克隆抗体和FACScan检测、^(125)I-rhIL-6的配基结合分析测定、地高辛配基标记的rhIL-6R cDNA探针的细胞原位杂交技术)分折了R细胞系在体外不同条件下传代过程中及给BN大鼠尾静脉回输后其rhIL-6R的表达。研究结果表明,用改良的磷酸钙共沉淀法将编码rhIL-6R cDNA和Neo^R基因的逆转录病毒表达质粒XM6/IL-6RNeo导入LT12细胞系后,受体细胞在体外含适当浓度G418的基质液中传代培养,可长期稳定表达rhIL-6R,给BN大鼠尾静脉回输后20天左右,其脾脏和骨髓细胞均可检测到rhIL-6R的明显表达,而且~3H-TdR掺入分析证明细胞膜表面所表达的rhIL-6R可以介导外源性rhIL-6信号传到细胞核内。