热休克蛋白90对hERG-A561V通道蛋白转运及通道功能影响的研究

目的探讨热休克蛋白90(Hsp90)对人类ether-a-go-go相关基因(hERG)-A561V通道蛋白转运及通道功能影响的研究。方法构建野生型(WT)、突变型(A561V)、杂合型(WT/A561V)细胞模型,采用蛋白质印迹法检测各组细胞hERG及Hsp90蛋白表达差异。转染减表达空载(Itf NC)、Hsp90减表达(Hsp90-)、过表达空载(Ovp NC)或Hsp90过表达(Hsp90+)质粒至各细胞模型(即Itf NC组、Hsp90-组、Ovp NC组、Hsp90+组),另设不加载体的对照(Ctl)组,采用蛋白质印迹法检测各组细胞调控Hsp90前后hERG及Hsp90蛋白表达差异。采用免疫荧光法检测Hsp90调控前后杂合型细胞模型hERG及Hsp90蛋白定位表达情况。采用全细胞膜片钳技术检测调控Hsp90前后杂合型细胞模型hERG通道激活电流及尾电流密度。结果突变型、杂合型细胞模型Hsp90及hERG(135 kDa)蛋白表达水平均较野生型明显升高(均P<0.05)。野生型细胞模型Hsp90+组hERG(135 kDa)、hERG(155 kDa)蛋白表达水平较Ctl组、Ovp NC组均明显升高(均P<0.05),突变型细胞模型Hsp90+组hERG(135 kDa)蛋白表达水平较Ctl组、Ovp NC组均明显升高(均P<0.05),杂合型细胞模型Hsp90+组hERG(155 kDa)蛋白表达水平较Ctl组、Ovp NC组均明显升高(均P<0.05)。融合Hsp90和hERG蛋白后,Ctl组hERG表达于细胞膜、细胞质,Hsp90-组细胞膜上hERG蛋白表达减少,Hsp90+组细胞膜上hERG蛋白表达增多。与Ctl组比较,Hsp90+组Ikr曲线左移14.709,斜率因子k值未见明显变化。杂合型细胞模型Ctl组、Hsp90-组、Hsp90+组激活电流及尾电流密度均在50 mV处达到最高;杂合型细胞模型Hsp90+组在20、30 mV处的激活电流密度均明显高于Ctl组、Hsp90-组(均P<0.05),在30、40 mV处的尾电流密度均明显高于Ctl组、Hsp90-组(均P<0.05)。结论Hsp90在hERG-A561V通道蛋白折叠转运中起作用,而上调Hsp90可促进WT/A561V hERG的折叠转运,进而影响通道功能。

蛋白酶体抑制剂ALLN对HERG-A561V蛋白转运异常的影响

目的研究蛋白酶体抑制剂ALLN对hERG-A561V突变蛋白转运异常的影响,并观察分子伴侣Calnexin(CNX)/Calreticulin(CRT)在此过程中的作用。方法瞬时转染pcDNA3-WT-hERG、pc DNA3-A561V-hERG、pc DNA3-WT/A561V-hERG、pc DNA3-L539fs/47-hERG、pcDNA3-WT/L539fs/47-hERG致HEK-293T细胞分别构建野生、突变和杂合型细胞模型;蛋白酶体抑制剂ALLN以10 mol/L的浓度孵育各组细胞模型24 h;运用免疫荧光检测ALLN干预前后h ERG蛋白在细胞内的分布情况,免疫共沉淀检测ALLN干预前后hERG蛋白与Calnexin/Calreticulin的结合情况。结果通过免疫荧光实验发现ALLN干预h ERG-A561V突变及杂合细胞模型后,胞浆及细胞膜均可见h ERG表达较干预前增加,而干预野生型h ERG和hERG-L539fs/47细胞24 h后,h ERG蛋白分布无明显变化。通过免疫共沉淀实验,发现相较野生型h ERG,分子伴侣Calnexin/Calreticulin与h ERG-A561V结合明显增多;ALLN干预各组模型24 h后Calnexin/Calreticulin表达增多,且h ERG-A561V突变及杂合组细胞模型h ERG蛋白与Calnexin/Calreticulin结合,相较野生hERG及h ERG-L539fs/47组明显增多。结论ALLN纠正了h ERG-A561V突变蛋白的转运障碍,临床有潜在治疗因基因突变致蛋白转运异常所致长QT综合征的可能性,且内质网分子伴侣Calnexin/Calreticulin可能在其中发挥重要作用。