含hFⅨ微小基因的杂合型逆转录病毒载体在小鼠成肌细胞中高效表达的研究

目的 探讨不同载体结构在成肌细胞中表达hFⅨ蛋白的效果 ,优化载体结构 ,为血友病B基因治疗提供实验依据。方法 制备带有两拷贝肌酸激酶增强子 (Me2 )和内含子m2 的三种逆转录病毒载体pLMe2Ⅸm2 SN (Me2正向插入 3′LTR的增强子区域 )、pLMe2Ⅸm2 SN(Me2反向插入 )及pLⅨm2 SN ,筛选高效表达hFⅨ的PA317细胞克隆 ,稳定转染成肌细胞 ,分别对单克隆及混合克隆的上清和细胞进行ELISA、PCR等检测及鉴定 ,并与pLⅨSN载体相比较。结果 不同逆转录病毒载体转染靶细胞后hFⅨ表达水平依次为LMe2Ⅸm2 SN(正向 ) >LMe2Ⅸm2 SN(反向 ) >LⅨm2 SN >LⅨSN ;增强子方向不同的两个载体表达水平差异有显著性 ,正向插入者蛋白表达量较反向插入者高 ;靶细胞中反向插入的Me2在 5′LTR中有不同程度的缺失 ,其方向未发生变化。结论 选择组织特异性增强子及优化FⅨ微小基因结构是提高表达水平的有效手段 。