人胎儿成骨细胞系hFOB1.19在骨组织工程中的应用

背景:现阶段广泛使用的动物成骨细胞模型的生物学特性与人细胞差距较大;原代人成骨细胞分离培养难提纯、培养代次有限;骨肉瘤细胞有异常生长的风险,都不能完全满足研究需求。1995年,有研究利用猴空泡病毒40转染了人胎儿四肢细胞,筛选得到一组具有分化为较早期成骨祖细胞——永生化人成骨细胞系hFOB1.19。目的:综述hFOB1.19的基本特性、培养方法及作为骨组织工程材料细胞模型的应用。方法:在中国知网、万方数据、SinoMed、PubMed、Web of Science、Medicine及Cochrane Library数据库中查找从1995年至2022年5月的相关文献,中文检索词为“人胎儿成骨细胞系1.19、人成骨细胞系、永生化细胞、猴空泡病毒40、骨组织工程、骨替代材料、生物材料研究”,英文检索词为“hFOB1.19,Human osteoblast cell line,Immortalized cells,Monkey vacuolating virus 40,Bone tissue engineering,Bone substitute materials,Biomaterials research”,筛选后得到73篇文献进行综述。结果与结论:(1)hFOB1.19在形态、表型、核型、生物学特性及分化潜能方面与体内成骨细胞高度相似,拥有快速且稳定的生长能力。(2)hFOB1.19已广泛应用于细胞黏附、增殖、分化、矿化、基因表达及蛋白合成方面,以检验骨组织工程材料的生物相容性及成骨性能。(3)hFOB1.19能够弥补动物细胞来源不同、骨肉瘤细胞异常增殖可能、原代成骨细胞分离难及传代次数少的缺点,在骨组织工程实验应用中性能稳定,增殖良好,但因培养条件特殊,细胞传代次数有限及生物安全性等方面的问题,目前在骨组织工程材料领域应用尚且不够广泛。(4)当前,骨组织工程材料发现速度快,但开发过程中缺乏系统全面的研究体系及统一的研究标准,文章总结hFOB1.19在不同研究中的应用,旨在为研究者们提供方法选择引导并推动相关标准完善。

铁调素对人成骨细胞(hFOB1.19)内钙离子转运的影响

目的研究铁调素对人成骨细胞(hFOB 1.19)内Ca2+转运的影响。方法将成骨细胞34℃下培养3～4 d至细胞密度为90%,用胰蛋白酶消化后分种于12孔培养板。空白组加双蒸水;实验组加不同浓度铁调素(双蒸水配制),包括H1组(终浓度为10 nmol/L)和H2组(终浓度为50 nmol/L)。干预24 h后用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)检测。结果成骨细胞内钙离子荧光强度空白组为56.38±36.47,H1组为68.01±32.90;H2组为154.06±55.62,3组间的差异有统计学意义(P<0.05)。结论铁调素可促进成骨细胞内Ca2+浓度增加。

铁离子对人成骨细胞(hFOB1.19)生物活性影响

目的探讨铁离子对成骨细胞株(hFOB1.19)生物活性,包括碱性磷酸酶活性(alkaline phosphatase activity,APA)、细胞凋亡、钙结节、Ⅰ型胶原(type 1 collagen,COL 1)和骨钙素(osteocalcin,OC)的影响。方法成骨细胞(hFOB1.19)于5%CO234℃培养箱内培养,将不同浓度枸橼酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)50、100、200μmol/L和去铁胺(deferoxamine,DFO)5、10、20μmol/L分别加入细胞培养基中,MTT法检测成骨细胞增生活性;碱性磷酸酶活性试剂盒检测碱性磷酸酶活性;流式细胞仪检测细胞凋亡;Von kossa染色法行钙结节染色;RT-PCR和Western blotting法分别检测COL1和骨钙素(bone gla protein,BGP)的基因及蛋白表达。结果 (1)48 h后增生活性:FAC组细胞增生活性随FAC干预浓度的增加呈剂量依赖性降低(P<0.05),DFO组在5μmol/L浓度组时促进成骨细胞增生,在10、20μmol/L浓度组时抑制成骨细胞增生。(2)10 d时碱性磷酸酶活性:FAC组碱性磷酸酶活性随FAC干预浓度的增加而降低,DFO组碱性磷酸酶活性随DFO干预浓度的增加而升高(P<0.05);(3)48 h时凋亡:FAC组细胞凋亡率呈剂量依赖性升高(P<0.05),DFO组在5、10μmol/L浓度时抑制细胞凋亡(P<0.05),在20μmol/L则促进成骨细胞凋亡(P<0.05);(4)21 d时钙结节染色:FAC组随铁离子干预浓度增加,成骨细胞矿化面积、钙结节形成数量均减少,DFO组在5、10μmol/L浓度时促进成骨细胞矿化功能,而20μmol/L浓度时对成骨细胞矿化有抑制效应;(5)3 d时基因及蛋白表达:FAC组COL1、BGP基因和蛋白的表达呈剂量依赖性下调(P<0.05);DFO组COLⅠ、BGP基因的表达呈剂量依赖性上调(P<0.05),DFO在5、10μmol/L浓度时促进COL1、BGP蛋白表达,在20μmol/L浓度时抑制COL1、BGP蛋白表达。结论不同浓度枸橼酸铁铵均抑制成骨细胞功能活性,提示高铁环境不利于成骨细胞的成骨功能。低铁环境对成骨细胞有双重效应,低剂量去铁胺对成骨细胞活性有促进作用,而高剂量去铁胺则对成骨细胞活性有抑制效应。

OTX2基因对hFOB1.19成骨细胞增殖和分化的影响

背景:研究成骨细胞的表达及分化有助于阐明骨性反牙合畸形下颌骨发育过度的分子机制。目的:应用RNA干扰技术下调成骨细胞系hFOB1.19中OTX2基因的表达,进一步研究OTX2基因对成骨细胞增殖及分化的影响。方法:实验分为6组:特异性OTX2-siRNA1、OTX2-siRNA2、OTX2-siRNA3组,GAPDH-siRNA组,阴性对照组和空白对照组。设计3个靶序列的小干扰RNA(iRNA),转染人成骨细胞hFOB 1.19。RT-PCR检测转染后成骨细胞中OTX2 mRNA水平的变化;Western Blot检测蛋白质表达水平;MTT法评估OTX2-si RNA对成骨细胞增殖的抑制作用;化学比色法检测细胞碱性磷酸酶活性。结果与结论:(1)转染后,出现OTX2 mRNA水平下调,蛋白表达水平下调;(2)倒置显微镜下观察漂浮细胞OTX2-si RNA组明显多于各对照组,细胞增殖抑制率明显高于各对照组,OTX2-si RNA组碱性磷酸酶活性明显降低;(3)结果提示,化学合成的特异性OTX2-siRNA转染人成骨细胞系hFOB1.19,能有效下调OTX2mRNA水平;OTX2基因表达下调能够抑制hFOB1.19成骨细胞增殖;OTX2基因表达下调可降低h FOB1.19成骨细胞碱性磷酸酶活性,抑制其分化。

人成骨细胞系hFOB1．19生物学特性的研究

本研究以成骨细胞系hFOB1.19(hFOBs)为对象,探讨成骨细胞在造血调控中的作用。采用RT-PCR检测hFOB多能干细胞的标志(Oct-4,Rex-1,hTERT)的表达及体外向脂肪细胞诱导分化程度,以测定其多向分化的能力。用流式细胞术(FCM)检测hFOB的细胞表型,RT-PCR检测细胞因子(SCF,IL-6,IL-11,SDF-1α,GM-CSF及G-CSF)的表达,并和骨髓来源的间充质干细胞(BM-MSC)进行比较。结果表明:hFOBs可表达Oct-4、Rex-1多能干细胞的标志,但不表达hTERT;体外诱导分化实验证实hFOB具有多向分化潜能。FCM发现hFOBs和BM-MSC具有相同的细胞表型,均表达CD44、CD73(SH3)、CD105(SH2)及CD90(Thy-1),但不表达CD34、CD45、HLA-DR等造血细胞标记。RT-PCR检测还发现:hFOBs和BM-MSC均表达SCF,IL-6,IL-11,SDF-1α等细胞因子mRNA,但hFOBs还能表达GM-CSF和G-CSF。结论:人成骨细胞系hFOB1.19可能是处于较早阶段的成骨祖细胞,表达多种造血相关的细胞因子,是研究成骨细胞调控造血的较好的模式系统。

铁调素及铁离子对人成骨细胞(hFOB1．19)内钙离子转运的影响

目的研究铁调素（Hepcidin）及铁离子对人成骨细胞（hFOB1．19）内Ca^2＋转运的影响。方法成骨细胞34℃培养3—4天至细胞密度为90％，胰蛋白酶消化后分种于12孔培养板（每孔内置一圆形盖玻片）。（1）空白组加入双蒸水，实验组加入不同浓度Hepcidin（双蒸水配制），干预24h后用激光共聚焦扫描显微镜（cLSM）检测；（2）空白组加入双蒸水，实验组加入不同浓度的DFO和FAC，分别干预后立即用激光共聚焦扫描显微镜检测。结果经激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）检测发现：（1）随着成骨细胞外Hepcidin浓度的升高，成骨细胞内钙离子的绿色荧光强度增强；（2）随着成骨细胞外DFO浓度的升高，成骨细胞内钙离子的绿色荧光强度增强；相反，随着成骨细胞外FAC浓度的升高，成骨细胞内钙离子的绿色荧光强度减弱。结论（1）Hepcidin可促进成骨细胞内Ca^2＋增加。（2）成骨细胞外Fe^3＋浓度的减少可以增加细胞内的Ca^2＋，而胞外Fe^3＋浓度增加则减少细胞内的Ca^2＋。

高铁环境对成骨细胞生物活性的影响

目的探讨高铁环境对人成骨细胞(hFOB1.19)活性指标的影响。方法采用细胞贴壁法培养成骨细胞(hFOB1.19)后,将不同浓度枸橼酸铁铵(50、100、200μmol/L)加入细胞培养基,用MTT法检测成骨细胞增生活性;碱性磷酸酶活性试剂盒检测碱性磷酸酶活性;流式细胞仪检测成骨细胞凋亡情况;Vonkossa染色法行钙结节染色;用RT-PCR和Western blotting分别检测Ⅰ型胶原(COL1)的基因及蛋白表达变化。结果用不同浓度枸橼酸铁铵干预成骨细胞后,与对照组相比,48 h与72 h组成骨细胞增生活性呈剂量依赖性降低,差异有统计学意义(P<0.05);48 h组成骨细胞凋亡率呈浓度依赖性升高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);不同浓度枸橼酸铁铵干预10 d和14 d时各组成骨细胞碱性磷酸酶活性均随枸橼酸铁铵浓度增高而降低,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,枸橼酸铁铵干预17 d后钙结节染色结果显示,矿化面积和钙结节形成随铁离子浓度增加而减少;枸橼酸铁铵干预3 d后呈剂量依赖性下调Ⅰ型胶原基因和蛋白的表达。结论高铁环境使成骨细胞成骨活性指标均受到抑制。

铁离子对人成骨细胞内钙离子转运的影响

目的研究细胞外铁离子(Fe3+)浓度变化对人成骨细胞(hFOB 1.19)内Ca2+转运的影响。方法将成骨细胞34℃培养3～4 d(细胞密度90%)并用胰蛋白酶消化后分种于12孔培养板上。空白组加入双蒸水;实验组加入不同浓度的去铁氨(DFO)和枸橼酸铁铵(FAC)。分别干预后立即用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)检测。结果CLSM显示,随着hFOB 1.19外Fe3+浓度的减少(DFO终浓度为200～300μmol/L),Ca2+向细胞内的转运量增加;而随着hFOB 1.19外Fe3+浓度的增加(FAC终浓度为50～100μmol/L),Ca2+向细胞内的转运呈降低趋势。结论hFOB 1.19外Fe3+浓度的减少可以增加细胞内的Ca2+,而胞外Fe3+浓度增加则减少细胞内的Ca2+。

人成骨细胞分化及骨保护素分泌:R-脊椎蛋白1通过Wnt/β-catenin通路的作用

背景:研究表明Wnt/β-catenin信号通路活性受抑是类风湿关节炎骨侵蚀的始动因素,增强该通路有望治疗类风湿关节炎关节破坏。R-脊椎蛋白1(RSpo1)可能是Wnt激活剂,尚无人成骨细胞相关研究。目的:验证R-脊椎蛋白1抑制DKK1促进该细胞的分化成熟。方法:给予S40转染人成骨细胞株h FOB 1.19 Wnt-3a、R-脊椎蛋白1及Wnt信号通路抑制剂DKK1不同刺激,通过检测细胞增殖、碱性磷酸酶活性及骨保护素水平,观察R-脊椎蛋白1在成骨细胞中的作用。结果与结论:R-脊椎蛋白1对hF OB 1.19细胞增殖无影响,Wnt-3a上调碱性磷酸酶活性,与R-脊椎蛋白1共刺激可增强该作用;R-脊椎蛋白1可减少DKK1对h FOB1.19细胞碱性磷酸酶活力的抑制作用。R-脊椎蛋白1可提高骨保护素质量浓度,但R-脊椎蛋白1对骨保护素的增强作用大于DKK1对其的抑制作用。提示R-脊椎蛋白1通过抑制DKK1,参与Wnt/β-catenin信号通路,促进成骨细胞分化成熟,分泌骨保护素。

黔岭淫羊藿总黄酮类成分对hFOB1.19人SV40转染成骨细胞活性的影响

目的:观察黔岭淫羊藿总黄酮类成分(YYH-C)对hFOB1.19人SV40转染成骨细胞活性的影响。方法:培养基连续培养hFOB1.19人SV40转染成骨细胞,采用MTT法测定细胞增殖率,全自动生化分析仪测定碱性磷酸酶(ALP)分泌水平,观察50,25,12.5,6.25,3.13,1.56,0.78,0.39,0.20 mg.L-1YYH-C与细胞培养72 h及连续多次给药与细胞培养1,4,7,10d时对细胞活性的影响。结果:0.78～50 mg.L-1的YYC-C与细胞共培养72 h,能明显促进细胞增殖,对细胞的最大增殖率达132.32%,0.78 mg.L-1剂量组尚能明显促进ALP的分泌;YYH-C连续给药1～4 d对hFOB1.19人SV40转染成骨细胞未见明显的增殖作用和明显的促进细胞分泌ALP的作用;自给药7 d开始,YYH-C不同质量浓度组显示出不同程度的促进细胞增殖的作用,YYH-C 0.78～25.0 mg.L-1呈现明显的量-效关系,随着质量浓度进一步的增大,对细胞的增殖作用不再增加,药效至少持续至给药10 d;12.5,25.0,50.0 mg.L-1在给药7 d,25.0,50.0 mg.L-1在给药10 d均能明显促进细胞分泌ALP。结论:YYH-C能明显促进hFOB1.19人SV40转染成骨细胞的增殖,且能明显促进细胞分泌ALP,提示YYH-C对成骨细胞活性的促进作用可能是其防治骨质疏松症的途径之一。

明胶水解物和酪蛋白水解物的成骨细胞增殖促进与抗凋亡作用

采用木瓜蛋白酶水解鲑鱼皮明胶和酪蛋白,得到3种水解程度的明胶水解物和酪蛋白水解物,然后通过细胞活力和流式细胞术分析,分别评价水解物对成骨细胞(h FOB.19)增殖和凋亡的影响。研究结果表明,明胶水解物和酪蛋白水解物对成骨细胞均具有明确的增殖促进作用,细胞活性分别增加103%~134%和100%~114%,水解物的水解度高,增殖促进作用大。明胶水解物和酪蛋白水解物对依托泊苷和氟化钠诱导的成骨细胞凋亡具有拮抗作用,凋亡细胞比例由31.7%下降至13.8%和22.6%(依托泊苷组),或者由19.5%下降至11.3%和17.5%(氟化钠组)。总体看,明胶水解物对成骨细胞的增殖促进和抗凋亡作用优于酪蛋白水解物。