人生长激素释放因子基因的合成和克隆

本文报道人生长激素释放因子(Leu^(27),Met^(44))hGRF(1-44)基因的合成和克隆。选用大肠杆菌高效表达所偏爱的简并密码子,用计算机辅助设计合成基因的顺序,用固相亚磷酸酰胺法合成了hGRF的6个寡聚核苷酸片段,长度分别为39至51个核苷酸,总共141个碱基对。通过酶促连接反应构建完整的hGRF基因,并直接克隆到pUC-19质粒中,克隆的宿主菌为E.coli JM83。通过抗性筛选、阳性标记筛选、限制酶分析和分子杂交确定阳性克隆株。用M13双脱氧末端终止法对克隆基因序列分析,证实合成和克隆的hGRF基因序列完全正确。

一种新的融合表达载体的构建

利用 L-ans B基因片段构建了融合表达载体 p EC,其中 L-ans B基因中编码唯一酸水解位点的序列已通过定点突变消除 ,并在它的 3′端引入了新的酸水解位点编码序列和方便外源基因插入的克隆位点 Bam H 和 Hind ,外源基因可从克隆位点 Bam H 和 Hind 处插入 p EC中 ,表达的融合蛋白用酸水解法加工后仅被切割成一大一小两个片段 ,不会导致产物混杂。 h GRF对它进行验证的结果显示 h GRF基因不仅能按正确的读码框插入 ,而且表达的融合蛋白与预期大小一致 ,说明 p

人生长激素释放因子基因的高效表达

将人生长激素释放因子 ( h GRF)基因和编码 L-天门冬酰胺酶 ( L- ans B) C-末端 12 6个氨基酸残基的基因片断进行融合表达 ,融合蛋白在菌体总蛋白中的比率达到 30 %左右 ,比和 L- ans B全基因融合表达时高得多 ,表达条件优化后 ,比率可增加到 4 5%。融合蛋白以不溶性的包含体形式存在。包含体的尿素抽提液经乙醇分级沉淀后得到较纯的融合蛋白 ,60 mmol/ L的盐酸水解融合蛋白 ,通过 SDS- PAGE和电喷雾质谱分析 ,融合蛋白释放出一分子量为 52 35.59Da的物质 ,而 GRF的分子量是 52 35.4 8Da,也就是说融合蛋白酸水解释放出了