携带hHCN4基因重组腺病毒载体体外转染大鼠BMSCs的实验研究

目的构建重组腺病毒载体Ad-hHCN4-IRES/eGFP在体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs),检测目的基因在BMSCs中mRNA和蛋白水平是否有表达。方法采用贴壁培养法分离纯化大鼠BMSCs;将携带hHCN4基因的重组腺病毒转染大鼠BMSCs,用荧光显微镜观察转染后BMSCs绿色荧光蛋白的表达,用RT-PCR和Western Blot法检测转染后hHCN4基因mRNA和蛋白水平的表达情况。结果 BMSCs成功贴壁分离传代。转染目的基因24 h后荧光显微镜下即观察到绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR法检测到有hHCN4 mRNA的表达,Western blot法检测到有其蛋白水平的表达。结论重组腺病毒载体转染的BMSCs能够表达hHCN4基因。

hHCN4基因修饰的大鼠BMSCs与心肌细胞共培养分化为心肌样细胞的实验研究

目的将超级化环化核苷酸门控阳离子通道4(hHCN4)基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)与乳鼠心肌细胞(CM)进行共培养,观察其细胞连接功能及起搏功能。方法分离培养乳鼠CM并进行细胞标记,将已标记的CM分别与大鼠BMSCs、hHCN4+BMSCs及hHCN4-BMSCs混合培养。共培养4d后检测各组细胞的自发搏动频率,荧光显微镜下观察两类细胞的空间位置关系,Western blotting检测缝隙连接蛋白43(Cx43)的表达,透射电镜观察细胞间缝隙连接的形成情况。结果共培养4d后,心肌的自发搏动频率明显增高。荧光显微镜下观察发现存在空间位置上相邻的BMSCs和CM。Western blotting结果显示,hHCN4+BMSC与CM共培养组Cx43表达明显高于hHCN4-BMSCs与CM共培养组。透射电镜观察显示,hHCN4+BMSCs可与相邻细胞形成指状交错的连接。结论 hHCN4基因修饰的大鼠BMSCs可与CM建立有效的电机械连接,其自发起搏功能更接近CM,为进一步进行生物起搏治疗提供了实验依据。